Summary
Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 3 описывает процесс флуоресцентно маркировки усиливается РНК из хозяина и вирусных образцов аминокислот аллилового связи красителей. Часть 3 из 3.
Abstract
Семья
Protocol
Часть 1: Арна маркировки: аминокислоты связи аллил из красителей
- Добавить 1 мкг образцов Арна в 1,5 мл труб микроцентрифужных.
- Вакуумные сухие образцы на низкой или нулевой температуре, пока они полностью не высохнут. Cap каждой трубки, как только она сухая - не пересушить!
- Добавить 9μl связи буфера в каждую пробирку и ресуспендируйте Арна, осторожно вортексе в течение 1 минуты. Центрифуга кратко собрать образец в нижней части трубки, а затем дать образец сидеть на льду.
- Добавить 22μl высокой ДМСО качества для каждой трубки Cy3 или Cy5 красителя. Один трубку краситель достаточно для 2 образцов. Красителя Cy3 для маркировки вашего эталонных образцов, и краситель Cy5 для маркировки ваши образцы тестов.
- Vortex красителей тщательно перемешать. Держите красителей в темноте, пока готов к использованию. Не готовьте красителя ранее чем за 1 час перед использованием. Убедитесь, что вода не попадает в красителях / ДМСО смесь в любой момент.
- Добавить 11μl подготовленных ДМСО / Су краситель для каждого образца. Хорошо перемешайте на вортексе мягко.
- Инкубируйте в течение 30-45 минут при комнатной температуре. Обложка образцы с фольги или держать их в ящик, чтобы минимизировать воздействие света.
- После инкубации, добавьте 4.5μl hydroxlyamine для каждого образца, чтобы утолить реакции. Хорошо перемешайте на вортексе мягко.
- Инкубируйте в течение еще 15 минут при комнатной температуре. Обложка образцы с фольги или держать их в ящик, чтобы минимизировать воздействие света.
Часть 2: Маркированный Арна очистке
- Vortex связывание РНК бисером кратко получить даже смесь перед использованием.
- Подготовка Арна Связывание Смешать при комнатной температуре. (Табл. 1)
- Хорошо перемешайте на вортексе.
- Aliquote буфера Арна Элюирование в 1,5 мл трубки и инкубировать при 50-60 ° С в течение не менее 10 минут.
- Добавить 70μl из Арна обязательным смеси для каждого образца и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
- Передача образца от пластины ПЦР для 96-луночного круглым дном тарелку.
- Добавить 50 мкл 100% изопропанола к каждому образцу и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
- Осторожно встряхните пластину на орбитальный шейкер, по крайней мере 2 минуты для тщательного перемешивания образцов.
- Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. Оставьте пластину на стенде, пока смесь не станет прозрачной и обязательным бисера гранулированный.
- Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант. Супернатант должен быть либо ярко-розовый или ярко-голубые на данный момент из-за неинкорпорированных молекул красителя.
- Удалите пластину из магнитного стенда.
- Добавить 100 мкл Арна промывочного раствора в каждую лунку и встряхните пластине в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при умеренной скорости. Бусины могут не расходиться на этот шаг.
- Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус.
- Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
- Удалите пластину из магнитного стенда.
- Повторите мыть 2-й раз с 100 мкл промывочного раствора Арна.
- После 2-й вымыть, обсушить бисером встряхиванием пластины в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при максимальной скорости. Не пересушить образцы!
- Элюировать Арна из бисера, добавляя 20 мкл предварительно нагретую Элюирование Арна буфера для каждого образца.
- Энергично встряхните пластину на орбитальном шейкере в течение 3 минут, а затем проверить, чтобы убедиться, магнитных шариков полностью рассеялись. Если нет, то продолжать дрожать.
- После магнитных шариков полностью рассеяны, перемещать пластину магнитного стоять, чтобы захватить магнитных шариков. Супернатант содержит в порядок, помечены образцы Арна, и должно быть или бледно-розового или бледно-голубым.
- Тщательно передачи элюировали Арна к новой пластинкой ПЦР (или ПЦР).
- (Необязательный шаг) Проверьте концентрацию РНК и количество красителя в образцах путем измерения 1.5μl на NanoDrop спектрофотометр использования Microarray модуля.
- Сразу гибридизации меченых Арна на микрочипов платформы на ваш выбор, или в качестве альтернативы, вы можете хранить помечены Арна при -80 ° С, пока вы не готовы к гибридизации.
Таблица 1 Арна Связывание Mix
| Реагент | Сумма за 1 реакция |
| Связывание РНК бисер * | 10 мкл |
| Бусы ресуспендирования Решение * | 4μl |
| 100% изопропанола ** | 6μl |
| Арна Связывание Концентрат буфера | 50 мкл |
* Смешать связывание РНК бисер сбусинка ресуспендирования решение первой
** Добавьте изопропанола и хорошо перемешать перед добавлением Арна обязательным концентрат буфера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические Шаги
При выполнении аминокислоты аллилового связи, очень важно для ресуспендирования красителя в ДМСО незадолго (менее 1 часа), прежде чем связь и убедиться в отсутствии воды попадает в красителях / ДМСО смеси, как он будет реагировать с активными группы по красителя. Не пересушивать РНК (можно высушить до 1-2UL, а не полностью высохнет), а также ресуспендируют в связи буфера. Во время реакции сочетания, держать реакции в темноте, с редкими и стряхивая со спином вниз по желанию.
Применение / Значение
Меченой РНК в результате такой протокол может быть гибридизированных к человеку, вирусные, или пользовательские микрочипы, чтобы оценить реакцию экспрессии генов в инфицированных клетках в культуре. Microarray платформах меняются, поэтому следуйте инструкции производителя для приготовления смеси из гибридизации меченого зонда.
Использование специально созданных poxvirus массив 1, мы смогли классифицировать гены в общие категории "рано" или "поздно", основанный на сроках гибридизации сигнала и действительно ли вирусной репликации ДНК, необходимые для стенограммы обнаружения. Мы наблюдали ожидается функциональных категорий генов в каждой временной класса (то есть, ожидается в начале, промежуточных и поздних генов) изменения, чтобы точные сроки транскрипции.
Методы, используемые в этой работе, в состоянии предсказать транскрипции генов вируса рано или поздно в цикл репликации, но труднее отличительной раннего только против генов с ранней и поздней промоутер с стенограммы с двойным раннего / позднего промотора может сохраняться и быть обнаружено на поздних временах. Кроме того, прогон транскрипции поздних вирусных генов могут влиять на сигнал в данный зонд / пятна на линейке, а РНК-гибридизации с массивом может исходить из назначенных ORF или вверх по течению ORF. Черепица массивы пытались решить эту проблему, однако проблемы остаются в обнаружении пробегать транскрипции использованием гибридизации подходов 2,3,4.
Хост транскрипционной модели также может быть оценена с помощью этих методов. Тем не менее, вакцины кодирует различные механизмы для подавления хоста ответов, и принимающих транскрипционный ответ может быть уменьшена по сравнению с другими стимулами 5,6,7,8. Так как выражение многих генов, участвующих в защите организма меняется после заражения, вклад вирусных генов, которые противодействуют иммунного ответа должны быть приняты во внимание.
Используя эти методы, карта транскрипционной сроки все вирусные гены могут быть выявлены и использованы для допроса функций от неизвестных вирусных генов. Кроме того, эти методы могут быть использованы, чтобы вскрыть сложные диалога между вирусом и хозяином. Эти методы широко применимы для других хост-системами возбудителя инфекции. Если возбудитель интереса не указал полиаденилированной мРНК, альтернативные методы могут быть использованы непосредственно этикетке общей РНК, без линейного усиления. Анализируя хозяина и выражение гена вируса во время синхронного инфекции, эти методы позволяют получить представление о взаимодействии вируса с принимающей клеточного окружения, а также принимающих против защиты от вирусной инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Уайтхед Институт стипендиаты фондов
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
