Summary
Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales. Parte 3 describe el proceso de etiquetado fluorescente del ARN amplificado de host y de muestras de virus mediante el acoplamiento de aminoácidos de alilo de los colorantes.
Abstract
La familia
Protocol
Parte 1: ARNA etiquetado: acoplamiento de alilo amino de los tintes
- Añadir 1 g de las muestras en tubos de microcentrífuga ARNA 1,5 ml.
- De vacío seca las muestras a fuego lento o no hasta que estén completamente secos. Cap cada tubo tan pronto como esté seca - no resecar!
- Añadir 9μl buffer de acoplamiento para cada tubo el ARNA suavemente vortex durante 1 minuto. Centrifugar brevemente para recoger la muestra en la parte inferior del tubo, y luego dejar que la muestra se sientan en el hielo.
- Añadir DMSO 22μl de alta calidad a cada tubo de Cy3 o Cy5 tinte. Un tubo de tinte es suficiente para dos muestras. El tinte Cy3 es para el etiquetado de las muestras de referencia, y el tinte Cy5 es para el etiquetado de las muestras de prueba.
- Vortex los tintes para mezclar a fondo. Mantenga los tintes en la oscuridad hasta que esté listo para su uso. No prepare tinte antes de 1 hora antes de usar. Asegúrese de que no entra agua en la mezcla de tinte / DMSO en cualquier momento.
- Añadir 11μl de los preparados DMSO / Cy medio de contraste para cada muestra. Mezclar bien por agitación suave.
- Incubar durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. Cubrir las muestras con papel de aluminio o de permanecer en un cajón para minimizar la exposición a la luz.
- Después de la incubación, añadir 4.5μl hydroxlyamine a cada muestra para detener la reacción. Mezclar bien por agitación suave.
- Incubar durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. Cubrir las muestras con papel de aluminio o de permanecer en un cajón para minimizar la exposición a la luz.
Parte 2: Etiquetado ARNA limpieza
- Vortex las cuentas de unión a ARN brevemente para obtener una mezcla homogénea antes de su uso.
- Prepare la mezcla ARNA unión a temperatura ambiente. (Tabla 1)
- Mezclar bien por agitación.
- Alícuotas del tampón de elución ARNA en un tubo de 1,5 ml y se incuba a 50-60 ° C durante al menos 10 minutos.
- Añadir 70μl de la mezcla de ARNA vinculante para cada muestra y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces.
- Transferencia de las muestras de la placa de PCR a una de 96 pozos de fondo redondo de la placa.
- Añadir 50μl de 100% de isopropanol a cada muestra y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces.
- Agitar suavemente la placa en un agitador orbital durante por lo menos 2 minutos para mezclar bien las muestras.
- Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. Dejar la placa en el soporte hasta que la mezcla se vuelve transparente y las cuentas de enlace tienen gránulos.
- Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante. El sobrenadante debe ser de un color rosa brillante o un azul brillante en este momento debido a las moléculas de colorante no incorporado.
- Retire la placa del soporte magnético.
- Agregar 100μl solución de lavado ARNA a cada pocillo y agitar la placa durante 1 minuto en un agitador orbital a una velocidad moderada. Cuentas puede no dispersarse en este paso.
- Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas.
- Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante.
- Retire la placa del soporte magnético.
- Repita el lavado de un tiempo de 2 ª con la solución de lavado 100μl ARNA.
- Después del lavado 2 º, seca los granos al sacudir la placa durante 1 minuto en un agitador orbital a la velocidad máxima. No resecar las muestras!
- Eluir el ARNA de las cuentas mediante la adición de 20μl Buffer precalentado elución ARNA a cada muestra.
- Agite la placa para la placa en un agitador orbital durante 3 minutos, a continuación, comprobar para asegurarse de que los granos magnéticos son totalmente dispersos. Si no, continuar agitando.
- Una vez que las partículas magnéticas se han dispersado totalmente, mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. El sobrenadante contiene el limpiado, etiquetados muestras Arna, y debe ser un color rosa pálido o azul pálido.
- Transferir cuidadosamente la ARNA eluye a una nueva placa de PCR (o los tubos de PCR).
- (Paso opcional) Comprobar la concentración de ARN y la cantidad de colorante en las muestras mediante la medición en un espectrofotómetro 1.5μl NanoDrop utilizando el módulo de microarrays.
- Inmediatamente hibridar el ARNA etiquetados en una plataforma de microarrays de su elección, o, alternativamente, puede almacenar el ARNA etiquetados a -80 ° C hasta que esté listo para la hibridación.
Tabla 1 ARNA unión Mix
| Reactivo | Importe para una reacción |
| * Cuentas de unión a ARN | 10μl |
| Resuspensión de bolas * Solución | 4μl |
| 100% de isopropanol ** | 6μl |
| ARNA Concentrado tampón de unión | 50μl |
* Mezclar los granos de unión a ARN con elcordón de solución de resuspensión primero
** Agregue el isopropanol y mezclar bien antes de añadir el concentrado de tampón de unión ARNA.
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Discussion
Los pasos críticos
Al realizar el acoplamiento de alilo amino, es muy importante para volver a suspender el tinte en DMSO en breve (menos de 1 hora) antes del acoplamiento y asegurarse de que no entra agua en la mezcla de tinta / DMSO, ya que reacciona con el grupo activo en el medio de contraste. No resecar el ARN (se puede secar a 1-2UL en lugar de secar por completo), y resuspender bien en el tampón de acoplamiento. Durante la reacción de acoplamiento, que la reacción en la oscuridad, con el parpadeo ocasional y girar hacia abajo si lo desea.
Application / Importancia
El ARN marcado como resultado de este protocolo puede ser hibridado con microarrays humanos, viral, o la costumbre de evaluar las respuestas de la expresión génica de las células infectadas en la cultura. Plataformas de microarrays varían, así que siga las instrucciones del fabricante para la preparación de la mezcla de hibridación de la sonda marcada.
El uso de un conjunto personalizado diseñado un virus de la viruela, hemos sido capaces de clasificar los genes en las categorías generales de "principios" o "finales" sobre la base de sincronización de la señal de hibridación y si la replicación del ADN viral se requiere para la detección de la transcripción. Hemos observado las categorías espera funcional de los genes en cada clase temporal (es decir, que se espera genes temprana, intermedia y tardía) variación en cuanto al momento exacto de la transcripción.
Los métodos utilizados en este trabajo son capaces de predecir los genes de virus de la transcripción temprano o tarde en el ciclo de replicación, pero tienen más dificultades para distinguir las primeras sólo frente a los genes con un promotor de principios y finales desde las transcripciones con un doble temprano / tardío promotor puede persistir y detectados en los tiempos finales. Además, la ejecución a través de la transcripción de finales de los genes virales pueden afectar a la señal en un sondeo determinado / lugar en la matriz, como el ARN que hibrida con la matriz puede haber venido de la ORF designado o aguas arriba ORF. Arreglos de baldosas han tratado de resolver este problema, sin embargo, sigue habiendo dificultades en la detección de ejecutar a través de la transcripción mediante enfoques basados en la hibridación 2,3,4.
Patrones de hosts de la transcripción también se pueden evaluar mediante estos métodos. Sin embargo, la vacuna codifica una variedad de mecanismos para inhibir las respuestas del huésped, y las respuestas de acogida de la transcripción puede ser disminuida en comparación con otros estímulos 5,6,7,8. Dado que la expresión de muchos genes implicados en la defensa del huésped se altera después de la infección, la contribución de los genes virales que contrarrestan las respuestas inmunitarias del huésped por lo tanto, deben ser tomados en consideración.
La utilización de estos métodos, un mapa de la fecha de la transcripción de los genes virales pueden ser identificadas y utilizadas para interrogar a las funciones de los genes virales desconocidas. Además, estos métodos pueden ser utilizados para analizar el diálogo entre los intrincados virus y el huésped. Estos métodos son ampliamente aplicables a otros sistemas de infección huésped-patógeno. Si el agente patógeno de interés no tiene poliadenilado ARNm, los métodos alternativos se pueden utilizar para etiquetar directamente el ARN total, sin amplificación lineal. Al analizar tanto el anfitrión como la expresión de genes del virus durante la infección sincrónica, estos métodos nos permiten comprender mejor la interacción del virus con el medio ambiente celular del huésped, así como defensas del huésped contra la infección del virus.
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Acknowledgments
Los becarios del Instituto Whitehead Fondos
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
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- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
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