Summary
호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 파트 3 찬란 염료의 아미노 알릴 결합에 의해 두 호스트 및 바이러스 샘플에서 증폭된 RNA를 라벨링 과정을 설명합니다. 3 부 3.
Abstract
가족
Protocol
1 부 : 아르나 라벨 : 염료의 아미노산 알릴 커플링
- 1.5mL microcentrifuge 튜브에 아르나 샘플 1μg을 추가합니다.
- 그들이 완전히 건조되기 전까지는 낮은 여부 열에 샘플을 건조 진공. 바로 그것이 건조 각 튜브 캡 - overdry 마세요!
- 각각의 튜브에 9μl 커플링 버퍼를 추가하고 부드럽게 1 분 vortexing하여 아르나을 resuspend. 튜브의 맨 아래에있는 샘플을 수집하기 위해 간략하게 원심 분리기, 다음 예제는 얼음에 앉아 보자.
- Cy3 또는 Cy5 염료의 각 튜브에 22μl 고품질의 DMSO를 추가합니다. 염료 중 하나 튜브 충분이 샘플입니다. Cy3의 염료가 참조 샘플 라벨을위한, 그리고 Cy5의 염료는 테스트 샘플 라벨입니다.
- 철저하게 혼합하기 위해 염료 소용돌이. 사용할 준비가 될 때까지 어둠 속에 염료 보관하십시오. 사용하기 전에 이전 1시간보다 염료를 준비하지 마십시오. 물이 언제든지 염료 / DMSO 혼합에 도착하지 있는지 확인하십시오.
- 각 샘플에 대한 준비 DMSO / 싸이 염료의 11μl를 추가합니다. 부드럽게 vortexing하여 잘 섞는다.
- 상온에서 30~45분에 대한 부화. 석박와 샘플을 표지 또는 조명에 노출을 최소화하기 위해 서랍에 보관하십시오.
- 부화 후, 반응을 담금질하기 위해 각 샘플에 4.5μl hydroxlyamine를 추가합니다. 부드럽게 vortexing하여 잘 섞는다.
- 상온에서 또 다른 15 분 동안 품어. 석박와 샘플을 표지 또는 조명에 노출을 최소화하기 위해 서랍에 보관하십시오.
2 부 : 아르나 청소 라벨
- 소용돌이 RNA 바인딩 비즈 간단히 사용하기 전에도 혼합물을 얻을 수 있습니다.
- 상온에서 아르나 바인딩 믹스를 준비합니다. (표 1)
- vortexing하여 잘 섞는다.
- 적어도 10 분 동안 50-60 ° C에서 1.5mL 튜브 및 부화에 아르나의 용출 버퍼 Aliquote.
- 각 샘플에 아르나 바인딩 믹스 70μl를 추가하고 3-4 회 위아래로 pipetting과로 잘 섞는다.
- PCR 플레이트에서 96 잘 왕복 하단 플레이트에 샘플을 전송합니다.
- 각 샘플에 이소프로판올 100 % 50μl를 추가하고 3-4 회 위아래로 pipetting과로 잘 섞는다.
- 부드럽게 철저하게 샘플을 혼합하기 위해 최소한 2 분 동안 궤도 쉐이크에 접시를 흔들.
- 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 혼합물이 투명하게되고 바인딩 비즈가 pelleted 때까지 법정에 접시를 남겨주세요.
- 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. 뜨는은 밝은 분홍색 또는 비법인 염료 분자로 인해이 시점에서 밝은 파란색이어야한다.
- 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 각 잘하는 100μl 아르나 와시 솔루션을 추가하고 중간 속도로 궤도 쉐이크에서 1 분 접시를 흔들. 구슬 완전히이 단계에서 분산되지 않을 수 있습니다.
- 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다.
- 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 세차에게 100μl 아르나 와시 솔루션 2 차 시간을 반복합니다.
- 2 차 세척 후, 최대 속도로 궤도 쉐이크 1 분에 대한 번호판을 흔들어하여 비즈를 건조. 샘플을 overdry하지 마!
- 각 샘플에 20μl preheated 아르나의 용출 버퍼를 추가하여 비즈에서 아르나을 Elute.
- 강력 3 분 궤도 쉐이크에 번호판을 흔들 다음 마그네틱 비즈가 완전히 분산되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않다면, 계속 떨고.
- 자기 비즈가 완전히 분산이되면, 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 뜨는은 청소, 표시 아르나 샘플을 포함하고 창백한 분홍색이나 하늘색 중 하나가 될 것입니다.
- 조심스럽게 새로운 PCR 플레이트 (또는 PCR 튜브)로 eluted 아르나를 전송합니다.
- (선택 단계)는 Microarray 모듈을 사용하여 NanoDrop 분광 광도계에 1.5μl를 측정하여 시료의 RNA 농도 및 염료의 양을 확인합니다.
- 바로 선택의 microarray 플랫폼에 표시된 아르나을 잡종, 또는 양자 택일로, 당신은 -80에서 레이블 아르나를 저장할 수 있습니다 ° C가 하이브 리다이 제이션을위한 준비가 될 때까지.
표 1 아르나 바인딩 믹스
| 시약 | 한 반응에 대한 금액 |
| RNA 바인딩 비즈 * | 10μl |
| 비드 Resuspension 솔루션 * | 4μl |
| 백퍼센트 이소프로판올 ** | 6μl |
| 아르나 바인딩 버퍼 컨센트레이트 | 50μl |
*와 RNA 바인딩 비즈를 믹스첫째 비드 resuspension 솔루션
** 이소프로판올를 추가하고 아르나 바인딩 버퍼 집중을 추가하기 전에 잘 섞는다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
중요 단계
아미노 알릴 커플링을 수행할 때, 그것은 결합하기 전에 바로 DMSO (미만 1 시간)에 염료를 resuspend하고 염료에있는 활성 그룹과 반응하므로 물이, 염료 / DMSO 혼합에 도착하지 않도록하는 것이 중요합니다. RNA (1 - 2uL보다는 완전히 건조까지 건조 가능) overdry 및 커플링 버퍼에 잘 resuspend하지 마십시오. 커플링 반응하는 동안, 가끔 flicking과 함께 어둠 속에서 반응을 유지하고 필요할 경우 스핀 다운.
신청 / 의의
이 프로토콜에서 발생하는 분류 RNA는 문화에 감염된 세포에 유전자 표현 반응을 평가하기 위해 인간, 바이러스, 또는 사용자 정의 microarrays에 hybridized 수 있습니다. Microarray 플랫폼 다양하므로 표시된 프로브에서 하이브 리다이 제이션 혼합물의 준비에 대한 제조 업체의 지침을 따르시기 바랍니다.
사용자 정의 설계 poxvirus 배열 하나를 사용하여, 우리는 바이러스성 DNA 복제는 성적표 감지에 필요한되었습니다 여부 "조기"또는 "늦은"하이브리드화 신호의 타이밍에 기반의 일반적인 범주로 유전자를 분류할 수 있었다. 우리는 전사의 정확한 타이밍에 각 시간적 클래스의 유전자의 예상 기능 범주 (즉, 초기 중급과 늦은 유전자를 예상) 변화를 관찰했다.
이 작품의 활용 방법은 지속하고 있습니다 초기 또는 복제주기의 후반 베꼈는데 바이러스 유전자를 예측할 수 있지만, 이중 늦은 / 이른 발기인과 성적 때문에 초기 늦게 모터와 유전자 비교 더 많은 어려움을 조기 전용 구별을 늦은 시간에 발견했습니다. 배열에 hybridizing RNA가 지정된 ORF 또는 업스트림 ORF에서 온 수 있기 때문에 이외에도, 후반 바이러스 유전자의 전사 -을 통해 실행, 배열에 지정된 프로브 / 지점에서 신호에 영향을 미칠 수 있습니다. 기와 배열이 문제를 해결하기 위해 시도해야하지만 도전 하이브 리다이 제이션을 기반으로 접근 2,3,4를 사용하여 녹음을 통해 실행 탐지에 남아 있습니다.
호스트 transcriptional 패턴은 이러한 방법을 사용하여 평가하실 수 있습니다. 그러나, 우두는 호스트 반응을 억제하는 메커니즘을 다양한 인코딩하고, 호스트 transcriptional 응답은 다른 자극 5,6,7,8에 비해 줄어들 수 있습니다. 호스트 방어에 관련된 많은 유전자의 표현은 감염 후 변경이기 때문에, 호스트 면역 반응을 중화 바이러스 유전자의 기여 따라서 고려하여야한다.
이러한 방법을 활용하여 모든 바이러스 유전자의 transcriptional 타이밍의지도를 식별하고 알려지지 않은 바이러스 유전자의 기능을 심문하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 바이러스와 호스트 간의 복잡한 대화를 해부하다을 이용하실 수 있습니다. 이러한 방법은 다른 호스트 병원체 감염 시스템에 광범위하게 적용됩니다. 관심의 병원체가 mRNAs을 polyadenylated이없는 경우, 다른 방법은 선형 증폭하지 않고, 직접 총 RNA 레이블을 사용할 수 있습니다. 동기 감염 동안 두 호스트 및 바이러스 유전자 발현을 분석함으로써, 이러한 방법은 우리가 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 환경뿐만 아니라 호스트 카운터 - 방어와 바이러스의 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
화이트 헤드 연구소 펠로 자금
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
