Summary
Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux. Partie 3 décrit le processus d'étiquetage de l'ARN par fluorescence amplifié à partir de l'hôte et des échantillons viraux par le couplage d'allyle aminés de colorants.
Abstract
La famille
Protocol
Partie 1: ARNa étiquetage: couplage allyliques aminés des colorants
- Ajouter 1 pg des échantillons dans des tubes à centrifuger ARNa 1.5ml.
- Vide sécher les échantillons à feu doux jusqu'à ce qu'ils ou pas sont complètement secs. Cap chaque tube dès qu'il est sec - ne pas trop sécher!
- Ajouter 9μl tampon de couplage à chaque tube et remettre les ARNa par un léger vortex pendant 1 minute. Centrifuger brièvement pour prélever l'échantillon dans le fond du tube, puis laisser l'échantillon reposer sur la glace.
- Ajouter 22μl de DMSO de haute qualité pour chaque tube de Cy3 ou Cy5 colorant. Un tube de colorant est suffisant pour deux échantillons. Le colorant Cy3 est pour l'étiquetage de vos échantillons de référence, et le colorant Cy5 est pour l'étiquetage de vos échantillons.
- Vortex les colorants pour bien mélanger. Gardez les colorants dans l'obscurité jusqu'au moment de servir. Ne pas préparer de teinture plus tôt que 1 heure avant utilisation. Assurez-eau ne pénètre pas dans le mélange colorant / DMSO à tout moment.
- Ajouter 11μl de DMSO préparées / Cy colorant pour chaque échantillon. Mélangez bien en vortexant doucement.
- Incuber pendant 30-45 minutes à température ambiante. Couvrir les échantillons de papier d'aluminium ou de les garder dans un tiroir pour minimiser l'exposition à la lumière.
- Après l'incubation, ajouter 4.5μl hydroxlyamine à chaque échantillon pour stopper la réaction. Mélangez bien en vortexant doucement.
- Incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Couvrir les échantillons de papier d'aluminium ou de les garder dans un tiroir pour minimiser l'exposition à la lumière.
Partie 2: Labeled ARNa nettoyage
- Vortex les perles liaison à l'ARN brièvement pour obtenir un mélange homogène avant utilisation.
- Préparer le ARNa Mix reliure à température ambiante. (Tableau 1)
- Mélangez bien au vortex.
- Aliquoter le tampon d'élution ARNa dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes.
- Ajouter 70μl de l'ARNa mélange de liant à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois.
- Transférer les échantillons de la plaque PCR de 96 puits à fond rond assiette.
- Ajouter 50 pl de 100% d'isopropanol à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois.
- Secouez doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes pour bien mélanger les échantillons.
- Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand jusqu'à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés.
- Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. Le surnageant doit être soit un rose vif ou d'un bleu vif à ce point à cause de molécules de colorant non constituées en société.
- Retirer la plaque du socle magnétique.
- Ajouter 100 ul Solution Laver ARNa dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l'agitateur orbital à vitesse modérée. Perles peut pas entièrement se dispersent à cette étape.
- Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques.
- Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant.
- Retirer la plaque du socle magnétique.
- Répétez le laver une fois 2 ème avec 100 ul Solution Laver ARNa.
- Après le lavage 2 ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 1 minute sur l'agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher les échantillons!
- Eluer la ARNa des billes en ajoutant 20 pi de tampon d'élution préchauffé ARNa à chaque échantillon.
- Secouez vigoureusement la plaque sur l'agitateur orbital pendant 3 minutes, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant.
- Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d'un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Le surnageant contient les nettoyer, les échantillons ARNa étiquetés, et devrait être soit un rose pâle ou bleu pâle.
- Soigneusement transférer le ARNa élué à une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR).
- (Étape facultative) Vérifiez la concentration en ARN et la quantité de colorant dans les échantillons en mesurant 1.5μl sur un spectrophotomètre NanoDrop utilisant le module biopuces.
- Immédiatement hybrider les ARNa étiquetés sur une plateforme biopuces de votre choix, ou, alternativement, vous pouvez stocker les ARNa étiquetés à -80 ° C jusqu'à ce que vous êtes prêt pour l'hybridation.
Tableau 1 ARNa Mix reliure
| Réactifs | Montant pour une réaction |
| Perles liaison à l'ARN * | 10 ul |
| * Remise en suspension de billes Solution | 4μl |
| 100% d'isopropanol ** | 6μl |
| Concentré ARNa Binding Buffer | 50 pl |
* Mélanger les perles de liaison avec l'ARNsolution de billes resuspension premier
** Ajouter l'isopropanol et bien mélanger avant d'ajouter le concentré de tampon de liaison ARNa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Étapes critiques
Lorsque vous effectuez le couplage aminé allyle, il est essentiel de remettre en suspension le colorant dans le DMSO sous peu (moins de 1 heure) avant l'accouplement et s'assurer eau ne pénètre pas dans le mélange colorant / DMSO, comme il va réagir avec le groupe actif sur le colorant. Ne pas trop sécher l'ARN (peut être séché à 1-2UL plutôt que complètement à sec), et remettre ainsi dans le tampon de couplage. Pendant la réaction de couplage, garder la réaction dans l'obscurité, avec pichenette occasionnels et spin bas, si désiré.
Application / Importance
Les ARN marqués résultant de ce protocole peut être hybridés pour la santé humaine, les biopuces virale, ou de la coutume pour évaluer les réponses expression des gènes dans les cellules infectées en culture. Plates-formes de biopuces varient, alors suivez les instructions du fabricant pour la préparation du mélange d'hybridation de sonde marquée.
En utilisant un tableau de poxvirus personnalisée conçue 1, nous avons été en mesure de classer les gènes dans les catégories générales de «début» ou «en retard» basée sur le calendrier du signal d'hybridation et de si oui ou non réplication de l'ADN viral est nécessaire pour la détection de transcription. Nous avons observé les catégories attendus fonctionnelle des gènes dans chaque classe temporelle (par exemple, devrait gènes précoces, intermédiaire et tardive) des variations quant au moment exact de la transcription.
Les méthodes utilisées dans ce travail sont en mesure de prédire les gènes du virus transcrit tôt ou tard dans le cycle de réplication, mais ont plus de difficulté à distinguer au début uniquement par rapport aux gènes avec un promoteur précoce et tardif puisque les transcriptions avec un double promoteur précoce / tardif peut persister et être détectées à temps de retard. En outre, l'exécution à travers la transcription des gènes viraux fin peuvent affecter le signal à une sonde donnée / tache sur le tableau, comme l'ARN s'hybridant au tableau peut-être venu de l'ORF désigné ou un amont l'ORF. Carrelage tableaux ont tenté de résoudre ce problème, cependant des défis demeurent dans la détection de courir à travers la transcription en utilisant des approches basées hybridation 2,3,4.
Schémas hôte transcriptionnelle peut également être évaluée en utilisant ces méthodes. Toutefois, la vaccine code pour une variété de mécanismes pour inhiber réponses de l'hôte, et réponses de l'hôte de la transcription peut être diminuée par rapport à d'autres stimuli 5,6,7,8. Depuis l'expression de nombreux gènes impliqués dans la défense d'hôte est modifié après l'infection, la contribution des gènes viraux qui neutralisent les réponses immunitaires de l'hôte doivent donc être pris en considération.
En utilisant ces méthodes, une carte de la synchronisation de la transcription des gènes viraux peuvent être identifiés et utilisés pour interroger les fonctions de gènes viraux inconnus. En outre, ces méthodes peuvent être utilisées pour disséquer le dialogue complexe entre le virus et l'hôte. Ces méthodes sont largement applicables à d'autres systèmes d'infection hôte-pathogène. Si l'agent pathogène d'intérêt n'a pas polyadénylé ARNm, des méthodes alternatives peuvent être utilisées pour marquer directement l'ARN total, sans amplification linéaire. En analysant à la fois l'hôte et l'expression des gènes du virus lors de l'infection synchrone, ces méthodes nous permettent de mieux comprendre l'interaction du virus avec l'environnement hôte cellulaire ainsi que l'hôte contre-défenses contre les infections virales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Fonds
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
