Summary
Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 3 beschrijft het proces van fluorescent labelen van de versterkte RNA uit zowel de gastheer en virale monsters door amino-allyl koppeling van kleurstoffen. Deel 3 van 3.
Abstract
De familie
Protocol
Deel 1: ARNA etikettering: aminozuren allyl koppeling van de kleurstoffen
- Voeg 1μg van de ARNA monsters in 1,5 ml microcentrifuge buizen.
- Vacuüm droog de monsters op een laag of geen vuur tot ze helemaal droog zijn. Cap elke buis, zodra het droog is - niet Kreukherstellend!
- Voeg 9μl koppeling buffer aan elke buis en resuspendeer de ARNA door voorzichtig vortexen gedurende 1 minuut. Centrifugeer kort aan het monster te verzamelen in de bodem van de buis, en laat het monster zitten op het ijs.
- Voeg 22μl hoge kwaliteit DMSO aan elke buis van Cy3 of Cy5 kleurstof. Een tube van de kleurstof is genoeg voor 2 monsters. De Cy3 kleurstof is voor het labelen van uw referentie monsters, en de Cy5 kleurstof is voor het labelen van de test monsters.
- Vortex de kleurstoffen aan goed te mengen. Houd de kleurstoffen in het donker pas klaar voor gebruik. Niet voor te bereiden kleurstof eerder dan 1 uur voor gebruik. Zorg dat er geen water krijgt in de kleurstof / DMSO mix op elk punt.
- Voeg 11μl van de bereide DMSO / Cy kleurstof aan elk monster. Meng goed door vortexen voorzichtig.
- Incubeer gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur. Bedek de monsters met aluminiumfolie of houd ze in een lade om de blootstelling aan het licht te minimaliseren.
- Na de incubatie, voeg 4.5μl hydroxlyamine aan elk monster om de reactie te doven. Meng goed door vortexen voorzichtig.
- Incubeer gedurende nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur. Bedek de monsters met aluminiumfolie of houd ze in een lade om de blootstelling aan het licht te minimaliseren.
Deel 2: Labeled ARNA clean-up
- Vortex het RNA binden beads kort om een homogene massa te verkrijgen voor gebruik.
- Bereid de ARNA Binding Mix op kamertemperatuur. (Tabel 1)
- Meng goed door vortexen.
- Aliquote Het Arna elutiebuffer in een 1,5 ml buis en incuberen bij 50-60 ° C gedurende ten minste 10 minuten.
- Voeg 70μl van de ARNA binding mix aan elk monster en meng goed door en neer te pipetteren 3-4 keer.
- Overdracht van de monsters van de PCR-plaat tot een 96-goed-ronde bodemplaat.
- Voeg 50μl van 100% isopropanol aan elk monster en meng goed door en neer te pipetteren 3-4 keer.
- Schud de plaat op een orbitale schudder gedurende minstens 2 minuten grondig mengen van de monsters.
- Verplaats de plaat een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen. Laat de plaat op de stand tot het mengsel wordt transparant en de binding kralen zijn pellets.
- Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant. Het supernatant moeten ofwel een fel roze of een heldere blauwe op dit punt te wijten aan de niet opgenomen kleurstof moleculen.
- Haal de plaat uit de magnetische stand.
- Voeg 100μl ARNA Wash Solution aan elk putje en schud de plaat gedurende 1 minuut op de orbitale schudder bij gematigde snelheid. Korrels kunnen niet volledig uiteen bij deze stap.
- Verplaats de plaat een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen.
- Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant.
- Haal de plaat uit de magnetische stand.
- Herhaal de wasbeurt een 2 e tijd met 100μl ARNA Wash Solution.
- Na de 2 e wassen, drogen de kralen door schudden van de plaat gedurende 1 minuut op de rondschudapparaat op maximale snelheid. Niet Kreukherstellend samples!
- Elueren Het Arna van de kralen door het toevoegen van 20μl voorverwarmde ARNA elutiebuffer aan elk monster.
- Schud de plaat op de orbitale schudder gedurende 3 minuten, daarna moet u controleren of de magnetische korrels zijn volledig verspreid. Zo niet, dan gaan schudden.
- Zodra de magnetische korrels volledig verspreid, verplaatst u de plaat aan een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen. Het supernatant bevat het opgeruimd, gelabeld ARNA monsters, en moet worden ofwel een bleke roze of een lichtblauw.
- Breng voorzichtig de geëlueerd ARNA om een nieuwe PCR-plaat (of PCR-buizen).
- (Optioneel stap) Controleer de RNA-concentratie en de hoeveelheid kleurstof in de monsters door het meten van 1.5μl op een NanoDrop spectrofotometer met behulp van de Microarray module.
- Onmiddellijk hybridiseren de gelabelde ARNA op een microarray platform van uw keuze, of als alternatief, kunt u de gelabelde ARNA bewaren bij -80 ° C tot je klaar bent voor hybridisatie.
Tabel 1 ARNA Binding Mix
| Reagens | Bedrag voor een reactie |
| RNA-Bindende Kralen * | 10μl |
| Bead resuspensie Oplossing * | 4μl |
| 100% isopropanol ** | 6μl |
| ARNA Binding Buffer Concentrate | 50μl |
* Meng de RNA-bindend kralen met dekraal resuspensie oplossing eerst
** Voeg de isopropanol en meng goed voor het toevoegen van de ARNA bindende buffer concentreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen
Bij het uitvoeren van het amino-allyl koppeling, is het essentieel om de kleurstof hersuspenderen in DMSO kort (minder dan 1 uur) voor het koppelen en er geen water in de kleurstof / DMSO mix, want het zal reageren met de actieve groep van de kleurstof te verzekeren. Niet Kreukherstellend RNA (kan gedroogd worden tot 1-2uL in plaats van volledig droog), en goed in de koppeling buffer resuspenderen. Tijdens de koppeling reactie, houden de reactie in het donker, met af en toe flicking en spin down indien gewenst.
Toepassing / Betekenis
De gelabelde RNA als gevolg van dit protocol kan worden gehybridiseerd met mens, virale, of aangepaste microarrays om genexpressie reacties te beoordelen geïnfecteerde cellen in cultuur. Microarray platforms variëren, dus volg instructies van de fabrikant voor de voorbereiding van hybridisatie mengsel uit gelabelde probe.
Met behulp van een speciaal ontworpen pokkenvirus matrix 1, waren we in staat om genen in te delen in de algemene categorieën van "vroege" of "te laat", gebaseerd op de timing van hybridisatie-signaal en het al dan niet virale DNA-replicatie nodig was voor transcriptie detectie. We zagen de verwachte functionele categorieën van genen in elke tijdelijke klasse (dat wil zeggen, de verwachte vroege, intermediaire en late genen) variatie met betrekking tot de precieze timing van de transcriptie.
De methoden gebruikt in dit werk zijn in staat om virus genen vroeg of laat in de replicatiecyclus overgeschreven te voorspellen, maar hebben meer moeite te onderscheiden vroeg alleen-versus genen met een vroege en late promotor sinds transcripten met een dubbele vroege / late promotor kan blijven bestaan en worden gedetecteerd op late tijden. Daarbij mag run-through transcriptie van late virale genen van invloed op het signaal op een gegeven probe / plek op de matrix, zoals de RNA hybridiseren aan de array kan afkomstig zijn van de aangewezen ORF of een upstream ORF. Tiling arrays hebben geprobeerd dit probleem op te lossen, maar uitdagingen blijven bij het opsporen van lopen door transcriptie met behulp van hybridisatie gebaseerde benaderingen 2,3,4.
Host transcriptionele patronen kunnen ook worden beoordeeld met behulp van deze methoden. Echter, vaccinia codeert voor een verscheidenheid van mechanismen om te remmen gastheer reacties, en host transcriptionele respons kan verminderd zijn ten opzichte van andere stimuli 5,6,7,8. Sinds de expressie van vele genen betrokken bij de afweer is veranderd na de infectie, moet de bijdrage van virale genen die host immuunreacties tegen te gaan dan ook rekening worden gehouden.
Gebruik makend van deze methoden kan een kaart van de transcriptionele timing van alle virale genen worden geïdentificeerd en gebruikt om de functies van onbekende virale genen te ondervragen. Daarnaast kunnen deze methoden worden gebruikt om de ingewikkelde dialoog tussen virus en gastheer ontleden. Deze methoden zijn over het algemeen van toepassing op andere gastheer-pathogeen infectie systemen. Als de ziekteverwekker van belang geen gepolyadenyleerde mRNA's, kunnen alternatieve methoden worden gebruikt om direct het etiket van de totaal RNA, zonder lineaire versterking. Door het analyseren van zowel de gastheer en virus genexpressie tijdens de synchrone infectie, deze methoden stellen ons in staat inzicht te krijgen in virus interactie met de gastheer cellulaire omgeving als gastheer contra-afweer tegen virusinfecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows fondsen
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
