Summary
Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression. Teil 3 beschreibt den Prozess der Fluoreszenzmarkierung der amplifizierten RNA aus beiden Gastgeber und virale Proben durch Amino Allyl-Kupplung von Farbstoffen.
Abstract
Die Familie
Protocol
Teil 1: aRNA Etikettierung: Aminosäuren Allyl-Kupplung der Farbstoffe
- Add 1 g der Proben in 1,5 ml aRNA Mikrozentrifugenröhrchen.
- Vacuum trocknen die Proben auf geringe oder gar keine Hitze, bis sie vollständig trocken sind. Cap jedes Rohr, sobald es trocken ist - nicht übertrocknen!
- Add 9μl Kupplungspuffer zu und die Dynabeads der aRNA durch vorsichtiges Vortexen für 1 Minute. Kurz zentrifugieren, um die Probe in den Boden des Röhrchens zu sammeln, und dann lassen Sie die Probe auf Eis zu sitzen.
- Add 22μl hochwertige DMSO in jedes Röhrchen von Cy3 oder Cy5-Farbstoff. Ein Rohr von Farbstoff ist genug für 2 Proben. Der Cy3-Farbstoff wird zur Kennzeichnung Ihrer Referenzproben und die Cy5 Farbstoff zur Kennzeichnung Ihrer Proben.
- Vortex die Farbstoffe zu durchmischen. Halten Sie die Farbstoffe in der Dunkelheit bis zur Verwendung. Bereiten Sie nicht Farbstoff früher als 1 Stunde vor dem Gebrauch. Achten Sie darauf, kein Wasser in den Farbstoff / DMSO-Mix zu jedem Zeitpunkt.
- Fügen Sie 11μl der vorbereiteten DMSO / Cy Farbstoff zu jeder Probe. Gut mischen durch Vortexen sanft.
- Inkubieren für 30-45 Minuten bei Raumtemperatur. Decken Sie die Proben mit Alufolie oder halten sie in einer Schublade, um Lichteinwirkung zu minimieren.
- Nach der Inkubationszeit, fügen 4.5μl hydroxlyamine zu jeder Probe, um die Reaktion zu stillen. Gut mischen durch Vortexen sanft.
- Inkubieren für weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur. Decken Sie die Proben mit Alufolie oder halten sie in einer Schublade, um Lichteinwirkung zu minimieren.
Teil 2: Labeled aRNA clean-up
- Vortex die RNA-Bindung Perlen kurz, um eine gleichmäßige Mischung vor Gebrauch zu erhalten.
- Bereiten Sie die aRNA Binding Mix bei Raumtemperatur. (Tabelle 1)
- Gut mischen durch Vortexen.
- Aliquot die aRNA Elutionspuffer in ein 1,5 ml Röhrchen und inkubieren bei 50-60 ° C für mindestens 10 Minuten.
- Fügen Sie 70μl der aRNA verbindliche Mix zu jeder Probe und mischen Sie gut durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal.
- Übertragen Sie die Proben aus der PCR-Platte, eine 96-Well-Rundboden-Platte.
- Add 50 ul 100% Isopropanol zu jeder Probe und mischen Sie gut durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal.
- Schütteln Sie die Platte auf einem Schüttler für mindestens 2 Minuten gründlich mischen der Proben.
- Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Lassen Sie die Platte auf dem Stand, bis die Mischung wird transparent und die Bindung Perlen haben pelletiert.
- Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen. Der Überstand sollte entweder ein helles rosa oder hellblau an dieser Stelle aufgrund der Personengesellschaft Farbstoffmoleküle werden.
- Die Platte aus dem magnetischen stehen.
- Add 100 &mgr; aRNA Waschlösung in jede Kavität der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei mäßiger Geschwindigkeit. Perlen können nicht vollständig in diesem Schritt zu zerstreuen.
- Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen.
- Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen.
- Die Platte aus dem magnetischen stehen.
- Wiederholen Sie die Wäsche ein 2. Mal mit 100 &mgr; aRNA Waschlösung.
- Nach dem 2. waschen, trocknen die Kügelchen durch Schütteln der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei maximaler Geschwindigkeit. Nicht übertrocknen Proben!
- Eluieren aRNA von den Perlen, indem 20 &mgr; l vorgewärmten aRNA Elutionspuffer zu jeder Probe.
- Kräftig schütteln, die Platte auf dem Schüttler für 3 Minuten, dann überprüfen Sie, ob die magnetischen Beads vollständig verteilt sind. Wenn nicht, weiter zittern.
- Nachdem die magnetischen Beads vollständig zerstreut haben, bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Der Überstand enthält die aufgeräumt, etikettiert aRNA Proben, und sollte entweder ein hellrosa oder hellblaue werden.
- Sorgfältig Übertragung der eluierten aRNA einen neuen PCR-Platte (oder PCR-Röhrchen).
- (Optionaler Schritt) Überprüfen Sie die RNA-Konzentration und der Menge an Farbstoff in den Proben durch die Messung 1.5μl auf einem NanoDrop Spektralphotometer mit der Microarray-Modul.
- Unmittelbar hybridisieren die markierten aRNA auf einem Mikroarray-Plattform Ihrer Wahl, oder alternativ können Sie die markierten aRNA bei -80 ° C lagern, bis Sie bereit für die Hybridisierung sind.
Tabelle 1 aRNA Binding Mix
| Reagens | Betrag für 1-Reaktion |
| RNA Binding Perlen * | 10 &mgr; l |
| Bead Resuspension Solution * | 4μl |
| 100% Isopropanol ** | 6μl |
| aRNA Binding Buffer Concentrate | 50 ul |
* Mix der RNA-Bindung Perlen mit dembead Resuspension Lösung zunächst
** Fügen Sie das Isopropanol und gut mischen, bevor Sie die aRNA Bindungspuffer konzentrieren.
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Discussion
Kritische Schritte
Bei der Durchführung der Amino-Allyl-Kupplung, ist es entscheidend, um den Farbstoff in DMSO kurz (weniger als 1 Stunde) vor der Kupplung resuspendieren und sicher kein Wasser in den Farbstoff / DMSO-Mix, wie es mit der aktiven Gruppe auf den Farbstoff reagieren wird. Nicht übertrocknen RNA (kann bis auf 1-2UL anstatt völlig trocken getrocknet werden), und resuspendieren und in dem Bindungspuffer. Während der Kupplungsreaktion, halten Sie die Reaktion in der Dunkelheit, mit gelegentlichen flicking und Spin-Down, falls gewünscht.
Anwendung / Bedeutung
Die markierte RNA aus diesem Protokoll kann von Menschen, virale oder benutzerdefinierte Microarrays hybridisiert werden, um die Genexpression Antworten auf infizierten Zellen in Kultur zu beurteilen. Microarray-Plattformen variieren, so folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Vorbereitung der Hybridisierung Mischung aus markierten Sonde.
Mit einem maßgeschneiderten Pockenvirus Array 1, konnten wir Gene in die allgemeinen Kategorien von "früh" oder "Ende" auf Timing Hybridisierungssignal basiert und ob virale DNA-Replikation für die Niederschrift Nachweis erforderlich war zu klassifizieren. Wir beobachteten den erwarteten funktionalen Kategorien von Genen in jeder zeitlichen Klasse (dh voraussichtlich Anfang, mittleren und späten Gene), wie sie auf den genauen Zeitpunkt der Transkription.
Die Methoden in dieser Arbeit verwendet werden, sind in der Lage, Viren Gene transkribiert früh oder spät im Replikationszyklus vorherzusagen, aber sie haben Schwierigkeiten zu unterscheiden früh nur gegen Gene mit einer frühen und späten Promotor seit Transkripte mit einem Dual frühen / späten Promotor kann bestehen bleiben und werden erkannt zu späten Zeiten. Darüber hinaus können Durchlauf Transkription der späten viralen Gene Signal an einer bestimmten Sonde / Spot auf dem Array beeinflussen, wie die RNA hybridisiert, um das Array aus dem ausgewiesenen ORF oder eine vorgeschaltete ORF kommen kann. Tiling Arrays haben versucht, dieses Problem zu beheben, aber Herausforderungen bleiben bei der Erkennung durch Transkription mit Hybridisierung Ansätze 2,3,4 laufen.
Host transkriptionelle Muster können auch mit Hilfe dieser Methoden werden. Allerdings kodiert Vaccinia eine Vielzahl von Mechanismen, um Host-Reaktionen hemmen, und Host-transkriptionellen Reaktionen können im Vergleich zu anderen Reizen 5,6,7,8 vermindert werden. Da die Expression vieler Gene in Immunabwehr beteiligten nach der Infektion verändert ist, sollte der Beitrag der viralen Gene, die als Host Immunantwort entgegenwirken daher berücksichtigt werden.
Mit Hilfe dieser Methoden können eine Karte der Transkriptions-Timing aller viralen Gene identifiziert und genutzt werden, um Funktionen von unbekannten viralen Gene zu verhören. Darüber hinaus können diese Methoden genutzt, um die komplizierten Dialog zwischen Virus und Wirt sezieren werden. Diese Methoden sind im Großen und Ganzen auch für andere Wirt-Pathogen-Infektion Systeme. Wenn der Erreger von Interesse nicht mRNAs polyadenyliert haben, können alternative Methoden verwendet werden, um direkt beschriften Sie die Gesamt-RNA werden, ohne lineare Verstärkung. Durch die Analyse der Wirt und Virus Genexpression während der synchronen Infektion, erlauben diese Methoden uns einen Einblick in Virus-Interaktion zu gewinnen mit dem Host-zelluläre Umgebung sowie Host-Zähler-Abwehr gegen Virusinfektionen.
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Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Funds
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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