وصفنا بروتوكول بسيطة لتحديد البروتينات التي تربط الدماغ إلى نهاية طول C الكامل لمستقبلات P2X2 ATP بوابات. ومن المتوقع التمديد والتطبيق المنهجي لهذه الطريقة لجميع المستقبلات P2X أن تؤدي إلى فهم أفضل للإشارات مستقبلات P2X.
القنوات الأيونية يجند بوابات الاتصالات متشابك تكمن في الجهاز العصبي 1. في الثدييات وجود ثلاث عائلات من يجند بوابات قنوات : حلقة السيستئين ، والغلوتامات بوابات ومستقبلات القنوات P2X 2. في كل حالة من الارسال ملزم يؤدي إلى فتح المسام التي من خلالها تتدفق أيونات لها الكهروكيميائية التدرجات. كثير من يجند بوابات قنوات هي أيضا نفاذا إلى أيونات الكالسيوم 3 ، 4 ، مما يشير الى المصب الأدوار 5 (على سبيل المثال تنظيم الجينات) التي قد تتجاوز مدة فتح القناة. وبالتالي يمكن أن يجند بوابات قنوات الإشارات عبر جداول زمنية واسعة النطاق من الألف إلى بضعة أيام. قد تعطى هذه الأدوار الهامة التي لا بد أن نفهم كيف يجند بوابات قنوات ايون تنظم نفسها من البروتينات ، وكيف أن هذه البروتينات توليف الإشارة. الدراسات الحديثة تشير إلى أن الكثير ، إن لم يكن كلها ، القنوات قد تكون جزءا من مجمعات البروتين يشير 6. في هذه المقالة نوضح كيفية التعرف على البروتينات التي ترتبط الجوانب C – محطة المجال مستقبلات P2X2 عصاري خلوي.
مستقبلات P2X قنوات الكاتيون ATP – بوابات وتتألف من سبع مفارز (P2X1 – P2X7). وأعرب على نطاق واسع مستقبلات P2X في الدماغ ، حيث توسط انتقال متشابك مثير وتيسير الإفراج قبل المشبكي العصبي 7. تم العثور على المستقبلات في الخلايا P2X منفعل وغير منفعل ، والتوسط في أدوار رئيسية في إشارات العصبية ، والتهاب القلب والأوعية الدموية ووظيفتها 8. P2X2 المستقبلات وفيرة في النظام العصبي 9 و هي محور هذه الدراسة. ويعتقد أن كل الوحيدات P2X لامتلاك شرائح غشاء two الممتدة (TM1 وTM2) مفصولة المنطقة خارج الخلية (7) وبين الخلايا وC N مصطلحات (الشكل 1A) 7. مفارز P2X 10 (P2X1 – P2X7) إظهار تسلسل تناظر ما بين 30-50 ٪ على مستوى الحمض الأميني 11. مستقبلات P2X تحتوي سوى ثلاث مفارز ، الذي هو أبسط رياضيات الكيمياء بين المستقبلات ionotropic. وP2X2 C – يتكون من 120 محطة الأحماض الأمينية (الشكل 1B) ويحتوي على عدة مواقع لرسو السفن الآراء البروتين ، ودعم الفرضية القائلة بأن P2X2 مستقبلات قد تكون جزءا من مجمعات الإشارة. لكن ، على الرغم من ونسبت عدة وظائف للمحطة – C من المستقبلات P2X2 9 وقد وصفت أية دراسة الشركاء الجزيئية التي الزوجان إلى الجانب هذا البروتين داخل الخلية عبر كامل طول C – محطة. في هذه الورقة أساليب وصفنا نهج البروتين لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع كامل طول C – محطة P2X2 من المستقبلات.
القنوات الأيونية هي فئة كبيرة من البروتينات الغشاء لا يتجزأ منها. أنها تحتوي على المياه تملأ المسام التي تسمح بشكل انتقائي حركة الأيونات أسفل التدرجات الكهروكيميائية بهم عبر غشاء البلازما. أيون قنوات مفتوحة بين البوابة ودول مغلقة. يتم تشغيل الخطوة المعزولة بواسطة أ…
SW ومعتمدة من قبل TMV NCRR وNHLBI في المعاهد الوطنية للصحة. BSK معتمدة من قبل وHS NINDS وNIGMS من المعاهد الوطنية للصحة.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
Acrylamide | Reagent | BIO-RAD | 161-0156 | |
Ampicillin | Reagent | VWR | VW1507-01 | |
Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma | A3678 | |
Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma | A7699 | |
Bradford reagent | Reagent | BIO-RAD | 500-0006 | |
Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24972 | |
Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD | 3860 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR | VW1474-01 | |
Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma | E8145 | |
Formic acid | Reagent | EMD | 11670-1 | |
Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma | H1758 | |
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma | 15502 | |
Iodoacetamide | Reagent | Sigma | I1149 | |
Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD | 1.00547.5007 | |
Leupeptin | Reagent | Sigma | L8511 | |
Lysozyme | Reagent | Sigma | 62971 | |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma | S7653 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma | S3014 | |
Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma | S7920 | |
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma | S6508 | |
Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma | P7626 | |
Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma | S8820 | |
Protein standard | Reagent | BIO-RAD | 161-0305 | |
Sarkosyl | Reagent | Acros | 61207 | |
Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma | L4509 | |
SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | BIO-RAD | 170-3125 | |
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma | T9281 | |
Tris base | Reagent | Sigma | T1503 | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma | T9284 | |
Trypsin | Reagent | Promega | V5111 | |
Tween 20 | Reagent | Sigma | P5927 | |
Water | Reagent | Burdick&Jackson | 365-4 | |
LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | ThermoFisher Scientific | ||
Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
B-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M6250 | |
Glycerol | EMD | GX0185-6 |