我们描述一个简单的协议,以确定大脑的蛋白质结合ATP门控P2X2受体的C末端全长。这种方法的延伸和系统应用到所有P2X受体预计将导致一个更好地了解P2X受体信号。
配体门控离子通道1在中枢神经系统的突触联系的基础。在哺乳动物中,有三个家庭的配体门控通道:循环的半胱氨酸,谷氨酸门控和P2X受体通道 2 。在每一种情况下变送器具有约束力,导致毛孔开放,通过离子流及其电化学梯度。许多配体门控通道,也渗透到钙离子的3,4,有下游信号的角色(如基因调控),可能会超过通道的开放时间。因此,配体门控通道信号在广泛的时间尺度从几毫秒到数天不等。鉴于这些重要的角色,有必要了解如何配体门控离子通道本身是由蛋白质所规管,以及如何将这些蛋白质可能调整的信号。最近的研究表明许多,如果不是全部的渠道可能是部分蛋白信号复合物6。在这篇文章中,我们将解释如何识别的蛋白质结合P2X2受体胞浆域的C -末端的各个方面。
P2X受体是ATP门控的阳离子通道,由7个亚基(P2X1,P2X7)组成。 P2X受体广泛表达在大脑中,在那里他们介导兴奋性突触传递和神经递质的释放 7的突触前便利。 P2X受体在兴奋和非兴奋性细胞介导的神经信号,炎症和心血管功能 8的关键角色。 P2X2受体在神经系统的9的丰富,是本研究的重点。每个P2X亚基被认为是拥有两个膜跨越段(TM1和TM2)的,由胞外区 7和细胞内的N和C末端(图1A)7分开。 P2X亚基10(P2X1,P2X7)显示30-50%的序列同源性氨基酸水平的 11 。 P2X受体只包含三个亚基,这是最简单的离子型受体的化学计量。 P2X2 C -末端由120个氨基酸(图1b)组成,并含有几种蛋白质对接的共识网站,支持这一假设P2X2受体信号复合物的一部分。不过,虽然有几个功能已被归因于P2X2受体9 C -末端没有研究描述分子的合作伙伴,这种蛋白质通过细胞内C -末端全长夫妇。在此方法纸中,我们描述了蛋白质组学的方法来识别与P2X2受体的C -末端全长相互作用的蛋白质。
离子通道是一个不可分割的膜蛋白的主要类。它们包含装满水的毛孔,选择性地允许跨质膜离子的运动了他们的电化学梯度。离子通道门打开和关闭状态之间。 P2X配体门控离子通道的情况下发射器(如ATP),或触发门控步骤是,它可能是由与其他蛋白的相互作用调节。在过去的十年见证在我们了解如何P2X受体结合ATP的13增加,但仍了解较少的辅助蛋白,在调节P2X功能方面的作用。在本议?…
SW和烟草花叶病毒是在美国国立卫生研究院支持的NCRR和NHLBI。 BSK和HS是由美国国立卫生研究院的NINDS和NIGMS支持。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
Acrylamide | Reagent | BIO-RAD | 161-0156 | |
Ampicillin | Reagent | VWR | VW1507-01 | |
Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma | A3678 | |
Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma | A7699 | |
Bradford reagent | Reagent | BIO-RAD | 500-0006 | |
Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24972 | |
Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD | 3860 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR | VW1474-01 | |
Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma | E8145 | |
Formic acid | Reagent | EMD | 11670-1 | |
Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma | H1758 | |
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma | 15502 | |
Iodoacetamide | Reagent | Sigma | I1149 | |
Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD | 1.00547.5007 | |
Leupeptin | Reagent | Sigma | L8511 | |
Lysozyme | Reagent | Sigma | 62971 | |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma | S7653 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma | S3014 | |
Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma | S7920 | |
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma | S6508 | |
Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma | P7626 | |
Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma | S8820 | |
Protein standard | Reagent | BIO-RAD | 161-0305 | |
Sarkosyl | Reagent | Acros | 61207 | |
Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma | L4509 | |
SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | BIO-RAD | 170-3125 | |
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma | T9281 | |
Tris base | Reagent | Sigma | T1503 | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma | T9284 | |
Trypsin | Reagent | Promega | V5111 | |
Tween 20 | Reagent | Sigma | P5927 | |
Water | Reagent | Burdick&Jackson | 365-4 | |
LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | ThermoFisher Scientific | ||
Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
B-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M6250 | |
Glycerol | EMD | GX0185-6 |