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Biology

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

doi: 10.3791/1178 Published: May 18, 2009

Summary

우리는 ATP - 문이 P2X2 수용체의 전체 길이 C 터미 너스에 바인딩 뇌 단백질을 식별하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 모든 P2X 수용체에 대한 확장 및이 방법의 체계적인 응용 프로그램은 P2X 수용체 신호의 더 나은 이해로 이어질 것으로 예상된다.

Abstract

리간드 - 게이 티드 이온 채널은 신경계 1 시냅스 커뮤니케이 션을 기초. 포유 동물에서 리간드 - 문이 채널의 세 가족이 있습니다 cys 루프, 글루 탐 산염 - 게이 티드과 P2X 수용체 채널 2. 각각의 경우에 송신기의 바인딩은 이온들이 전기 그라디언트를 흘러이를 통해 기공의 개통에 이르게한다. 많은 리간드 - 문이 채널은 또한 하류 채널 개방 시간을 초과할 수 있습니다 역할 5 (예 : 유전자 규정)을 신호가 칼슘 이온 3, 4에 투과 수 있습니다. 따라서 리간드 - 문이 채널 몇 밀리초에서 일에 이르기까지 광범위한 시간 단위 이상의 신호 수 있습니다. 그것이 자신이 단백질에 의해 규제하는 방법 리간드 - 게이 티드 이온 채널을 이해하기 위해 필요하며, 어떻게 이러한 단백질이 중요한 역할을 감안할 때하면 신호를 조정할 수 있습니다. 최근 연구 많은 경우 전부는 아니 채널이 단백질 신호 단지 6 일부가 될 수있다하는 것이 좋습니다. 이 문서에서 우리는 P2X2 수용체 cytosolic 도메인의 C - 말단 부분에 바인딩 단백질을 식별하는 방법에 대해 설명합니다.

P2X 수용체는 ATP - 게이 티드 양이온 채널이 일곱 subunits (P2X1 - P2X7)로 이루어져 있습니다. P2X 수용체 널리들이 흥분성의 시냅스 전송 및 신경 전달 물질 릴리스 7 presynaptic 촉진을 중재 두뇌에 표현됩니다. P2X 수용체는 고르기가 아닌 고르기 세포에서 발견의 연결 신호, 염증과 심장 혈관 기능 8 키 역할을 중재하고 있습니다. P2X2 수용체는 신경계 9 풍부하고 본 연구의 초점입니다. 각 P2X의 subunit는 세포외 지역 7 세포내 N과 C 테르 (그림 1A) 7로 구분이 멤브레인 스패닝 세그먼트를 (TM1 & TM2) 소유로 생각됩니다. P2X의 subunits 10 (P2X1 - P2X7)는 아미노산 수준 11시 30~50% 시퀀스 상동을 보여줍니다. P2X 수용체가 ionotropic 수용체 중에서 가장 단순한 stoichiometry는 단지 세 subunits를 포함합니다. P2X2의 C - 말단 120 아미노산 (그림의 1B)로 구성되어 있으며, P2X2 수용체는 신호 단지의 일부가 될 수있는 가설을 지원하는 여러 단백질 도킹 합의 사이트가 포함됩니다. 몇 가지 기능이 P2X2 수용체 9 C - 말단에 기인하고 있지만 그러나, 연구는 분자 파트너 설명도 없어 그 전체 길이 C - 말단을 통해이 단백질의 세포 내쪽으로 몇 가지. 이 방법은 종이에 우리는 전체 길이 P2X2 수용체의 C - 말단과 상호 작용하는 단백질을 식별할 수있는 proteomic 방법을 설명합니다.

Protocol

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실험 절차

실험 절차 (그림 2) 아래 단계 현명한 방식으로 설명하는 네 부분으로 구성되어 있습니다.

1 부 : P2X2 수용체의 C - 말단의 Subcloning, 그리고 표현.

우리는 바인딩하는 뇌 단백질을 식별하는 전체 길이 박테리아 P2X2 수용체의 C - 말단을 표명했습니다.

  1. P2X2 수용체 (그림 1)의 C ​​- 말단은 (잔류물 353-472) pGEX 4NT1 (GE 생명 과학)로 복제 및 시퀀싱과 검증, PCR에 의해 증폭되었다.
  2. 재조합 플라스미드가 E.으로 변화되었다 재조합 단백질의 표현에 대한 대장균 (BL21).
  3. 플라스미드 P2X2 CT - GST를 포함하는 박테리아 (E. 대장균 BL21)의 글리세롤 주식은 멸균 피펫 팁과 스크랩한 적합 선택적 마커 (50 G / ML 암피실린)와 함께 Luria - Bertani (LB) 미디어 5 ML에 주사했다 37C에서 궤도 통에 하룻밤 incubated.
  4. 600 nm의에서 광학 밀도가 도착할 때까지 밤새 재배 문화는 적절한 항생제 (50 μg / ML 암피실린)와 LB 미디어 250 ML에 주사하여 37C에서 2-3 시간 250 rpm으로 궤도 통에 incubated되었습니다 ~ 0.6-0.7.
  5. 문화 IPTG의 1 ㎜로 유도 나아가 단백질 표현을위한 3 시간을 위해 37C에 incubated했다.
  6. 문화 다음 4C (문화의 1ml이 표현 수준을 분석 저장하고 '유도'로 표시했습니다) 15 분 5천그램에 소용되었다. 뜨는은 폐기되었으며 펠렛은 살린 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (인트) 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎜의 산도 8.0) 20 ML에 resuspended되었습니다.
  7. 정지 50 ML 팔콘 튜브에서 15 분 5,000g에 소용되었다. 뜨는은 폐기되었으며 세미 드라이 펠렛은에 - 70C가 하룻밤 냉동했다.
  8. - 70C 펠렛은 얼음 차가운 용해 완충액 (2 % (W / V) sarkosyl 15 MG 라이 소 자임, 150 MM NaCl, 트리스 pH7.5 50 MM, 5 MM의 DTT 완벽한 테아제 억제제 정제) 40 ML에 resuspended되었습니다 그리고 정지 30 분 얼음 incubated되었습니다. 이 부화하는 동안, 3 ML 글루타티온 - 세파 로스 4B 비즈는 인산 버퍼 살린 (PBS)과 PBS 다음 20 ML T - PBS (0.1 % (V / V) PBS에서 tritonX - 100) 20 ML로 세탁했다. 비즈는 1 ML PBS에서 resuspended되었습니다.
  9. 세균 현탁액 액체 질소에 3 번 동결 - 해동 및 sonicated (1S ON / OFF, 얼음 3 분 30 마이크론)와 추가 4퍼센트 30 분 (V / V) 트리톤 X - 100, 10 MM MgSO에 대한 incubated되었습니다 4 얼음 2 MM ATP.
  10. lysate는 (펠렛 1 뜨는의 ML cytosol과 세포막에있는 단백질의 양을 테스트 SDS 페이지에 저장된에서 샘플) 삭제되었습니다 4C 및 펠릿 15 분 2만그램에 소용되었다. 뜨는은 1 시간 (또는 야간) 4C에 대한 주판으로 incubated했다.
  11. 구슬은 5 분 500g에 늘인되었으며 뜨는가 (예제는 언바운드 분율 저장되었습니다) 삭제되었습니다. 구슬은 T - PBS 다섯 번 (세척은 세척 컨트롤에 대한 저장된)로 세탁했다.
  12. 구슬 그런 다음 50 % (W / V에게) 슬러리를 제공하기 위해 PBS에 resuspended 및 사용까지 4C에 냉장고에 저장되었습니다. 단백질 농도는 브래드 분석 (제조 업체의 지침에 따라)에 의해 추정되었다.

2 부 : 전체 두뇌 lysates의 준비

P2X2 수용체가 다량으로 뇌 8 표현하는 것으로 알려져 있습니다. 현재 분석에서 우리는 쥐의 뇌 전체 lysates (그림 3)에서 P2X2 수용체와 상호 작용하는 단백질을 식별하는 모색.

  1. 성인 쥐 두뇌는 수확 (동물 UCLA IAACUC 승인 프로토콜에 따라과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 희생되었다)와 즉시 얼음 차가운 PBS (3 배)을 씻어서했습니다.
  2. 10 ML (수확 뇌의 ~ 5 배 젖은 무게) 150 MM를 포함하는 얼음 차가운 용해 버퍼의 NaCl, 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM EGTA, 1 MM NaF, 1 ㎜ 셀을 lyse하기 나 3 할머니 4, 1 ㎜ PMSF, 5 류펩틴의 μg / ML, 1 % (V / V) NP - 40, 그리고 프로 테아제 억제제 칵테일의 정제는 수확 두뇌에 추가되었습니다.
  3. 균질 일관성의 혼합물이 달성되기 전까지는 뇌 조직은 유리 다운스의 균 질기와 얼음 homogenised되었습니다.
  4. 세포 lysate은 깨지지 세포를 제거하는 5 분 2,000그램에 소용되었다. 뜨는은 그대로 organelles 및 멤브레인 집계를 제거하는 60 분 2만9천g에서 다시 수집 소용되었다.
  5. 즉시 원심 분리 후 뜨는은 깨끗한 튜브로 이송되었다. 전체 뇌 lysate의 단백질 농도는 브래드 포드 분석에 의해 측정되었다 (보통 ~ 15 MG / ML).
  6. lysate는 aliquoted과에서 - 70C 저장되었습니다.

파트 3 : P2X2 C - 꼬리 관련 단백질의 분리

전체 뇌 lysates에서 P2X2 CT - GST의 바인딩 파트너를 식별하려면 분석 아래로 끌어가 CT - G를 사용하여 수행되었습니다ST 미끼로 글루타티온 세파 로스 4B 비즈를 고정. 컨트롤, 구슬로 바운드 혼자 GST를 사용했습니다.

  1. 브레인 lysate는 4C에서 1 시간에 대한 GST 비즈와 precleared했다. 펠렛은 폐기되었으며 뜨는은 추가 분석을 위해 사용되었다.
  2. GST와 P2X2 글루타티온 세파 로스 4 B 비즈에 바운드 CT - GST (10 μg)의 동등한 양의 용해 버퍼에 4C에서 회전, 쥐의 뇌 전체 lysate에서 precleared solubilised 단백질 100g과 함께 하룻밤 incubated되었습니다.
  3. 비즈 5 분 1천g에 늘인되었으며 뜨는가 삭제되었습니다.
  4. 구슬은 용해 버퍼와 한번 세탁하고 수정 Laemli 버퍼에 삶은되었습니다 [4 % (W / V) SDS, 10 % (V / V) 2 - 메르 캅 토 에탄올, 2 % (V / V) 글리세롤, 0.004 % (W / V) bromophenol 청색과 0.125 M TrisCl 산도 6.8] 5 분.
  5. 샘플은 5 분와 10 % SDS - PAGE (그림 4)로 구분하여 뜨는 위해 5,0​​00그램에 소용되었다. 젤은 SYPRO 루비 단백질 얼룩 젤 (제조 업체의 지시에 따라)과 자외선을 시각 물들일되었습니다. P2X2 CT - 관련 단백질은 미끼로 GST - NULL을 사용하여 복구 사람과 비교했다. 네 생물 학적는 (4 머리과 네 개의 독립적인 끌어 오기 때로는 IE) 수행되었습니다 복제합니다.

4 부 : 단백질의 식별.

겔 전기 영동에 의해 분리된 단백질은 젤에서 excised 및 질량 분석법 12 확인되었습니다 참고 :. 프로세스 전반에 걸쳐 먼지의 부재는 각질 오염을 줄이기 위해 중요합니다. 실험자는 항상, 헤어 네트와 장갑을 얼굴 마스크를 착용하고 장갑을 사용하지 않고 관심의 겔 영역을 터치하지 않습니다.

  1. 아래 P2X2 당겨에서 발견한 모든 보이는 단백질 밴드는 깨끗한 면도날로 excised하고 (그림 4) 절단되었습니다. GST - NULL에 젤의 해당 영역 레인 풀다운도의 수준 아래의 단백질의 존재를 확보하기 위해 밴드 얼룩 (GST - NULL 미끼 특정 밴드도 excised 및 식별되었다)에 관계없이 동일한 방식으로 excised되었습니다 얼룩의 감도는보고되지 않았습니다.
  2. 겔 조각은 200 50 % 50 MM의 탄산수 소 암모늄의 μl (V / V) acetonitrile (ACN)과 RT 15 분 vortexed 튜브 incubated되었습니다. 이 세척 단계를 반복합니다.
  3. 겔 조각 200 μl acetonitrile (겔 조각이 수축 및 색상의 불투명 될한다)를 추가하여 탈수 있었다.
  4. Acetontrile 제거하고 젤 조각 ~ 10 분 speedvac에서 건조되었다.
  5. 겔 조각 그런 다음 조각을 담가에 신선한 10 MM MM DTT/10 트리스 (2 - 카르복시 - 에틸) 충분한 볼륨의 phosphine 하이드로 클로라이드 (TCEP) 30 μl와 incubated했다. 이것은 56C 물을 욕조에 30 분 남았는데.
  6. 다음 DTT 솔루션 100 μl 500 50 % acetonitrile 솔루션 MM의 탄산수 소 암모늄 및 ammounium의 중탄산염로 씻은 겔 슬라이스로 대체되었습니다.
  7. 세탁 솔루션은 aspirated과 acetonitrile 200 μl가 젤을 탈수에 추가되었습니다.
  8. Acetonitrile 그런 다음 제거 100 μl 신선한 100 MM의 iodoacetamide 솔루션 무료 sulfhydryls을 alkylate에 추가되었습니다. 이 단계는 어둠 속에서 실온에서 25 분 진행.
  9. Iodoacetamide 솔루션은 제거하고 vortexing하면서 겔 조각은 2 분 50 % acetontrile (산도 8.0) 50 MM의 탄산수 소 암모늄 200 μl로 세탁했다. 이 세척 단계가 반복되었다.
  10. 세척 용액을 제거한 후 겔 조각 그러면 ~ 10 분 대한 speedvac에 의해 제거되었습니다 200 μl acetonitrile와 incubated했다.
  11. 이 단계에서는 겔 조각은 트립신의 소화를 위해 준비가되어 있습니다. 젤 조각은 30 μl 트립신 용액 (20 μL / NG 작업 농도)에 incubated 잘 부푼 수 젤류 10 분 얼음에 배치했다. 초과 트립신은 제거하고 그들은 37C에서 12~16시간 위해 진행하는 허용했다 소화에 걸쳐 포장되어 보관 50 MM의 탄산수 소 암모늄 30 μl와 중첩 겔 입자를 rehydrated했다.
  12. 5 % 다섯 μl (V / V) 개미의 산성은 트립신과 체포 소화를 비활성화에 추가됩니다.
  13. 튜브는 ~ 15 분 vortexed 후 깨끗하고 표시 0.5 ML의 약병으로 전달했던 튜브의 바닥에 액체를 가지고 간단히 centrifuged했다.
  14. 그들은 단지 간단한 원심 분리로 구분하여, 10-15 분 두 vortexing 다음 적용 너무나도 50 % acetonitrile에 0.1 %의 향후 30 μl (V / V) 개미의 산성은 겔 조각에 추가되었습니다. 이 단계는 단계 사이의 산성 - acetonitrile 개미의 교체, 한 번 반복했다.
  15. 최종 액체는 하나의 약병에 제거하고 모든 추출 솔루션을 결합했다. 이 볼륨은 speedvac에서 ~ 30 UL로 축소되었다. 샘플은 현재 대량 분석법에 의해 반대로 위상 나노 액체 크로마 토그래피 및 단백질 식별을 위해 준비했습니다. 이 특정 예제에서,이 단계는 ThermoF에서 Orbi - 트랩 탠덤 질량 분석기에서 수행됩니다다른 모델 및 제조 업체의 악기가 쉽게이 시점에 설명된 방식으로 결합 수 있지만 isher (높은 질량 정확성, 단백질 검출을위한 빠른 듀티 사이클 일반적으로 강력한 운영 기능 선택).
  16. 대량 spectrometric 분석에 대한 자세한 내용 및 기준은 이제 간단히 소개하는 부분이있다. 모든 펩티드는 반대 위상 나노 LC (Eksigent)와 펩티드가 3 μl / 분 유량에서 C18 리버스 위상 칼럼에 로드된되었다로 구분되었다. 모바일 위상 0.1 % 개미 산성과 물에 2 % ACN했습니다, 모바일 위상 B는 0.1 % 개미 산성과 ACN 20 %의 물이되었다. 펩티드는 220 NL / 분 5 분 이상 95 % B로 다음 90 분 이상 50 % B로 5 % B에서 선형 그라디언트를 사용 유량에있는 기둥에서 eluted, 그리고 마지막 5 분 지속적인 95 % B를 유지했다 . 스펙트럼은 MS / MS 검사에 대한 MS의 검색 및 LTQ 사용되는 Orbi - 트랩과 함께 데이터 종속 모드로 인수되었습니다. 펩티드는 Bioworks 소프트웨어 패키지에 통합된 SEQUEST 알고리즘을 사용하여 쥐의 IPI 데이터베이스 v.3.53에 대한 스펙트럼을 검색하여 확인되었다. 각 펩티드는 다음 기준을 충족 : XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (3), 그리고 DeltaCN> 0.1. 단백질 식별에 사용되는 모든 스펙트럼은 수동 검사 및 채 2 펩티드가 확인되었을 때 어떤 단백질 허용되지 않았습니다. 단 단백질은 GST - NULL 끌어 오기 다운즈 동안 네 개의 P2X2 끌어 오기 양지 각각 결석 다음 현재는 추가 분석을 위해 고려되었다.

그림 1

그림 1. P2X2 수용체의 subunit의 도식 표현. A.이 만화는 P2X2 수용체의 subunit의 토폴로지를 보여줍니다. cytosolic 도메인 N과 C 테르 미니 (Termini)로 구성되어 있습니다. P2X2 수용체 (적색)의 C - 말단은 분석 풀다운을위한 미끼로 사용되었습니다. 본 연구에서 사용되는 P2X2 수용체의 C - 말단의 B. 아미노산 서열은.

그림 2. 플로우 차트와 표현에 사용되는 프로토콜의 시간 라인, 정화는 풀다운 및 단백질의 식별. 우리는 시간 라인 프로토콜의 개요를 보여줍니다. 성인 쥐 두뇌 lysate은 즉시 assays 풀다운을 위해 사용하기 전에 신선 준비했습니다.

그림 3. 쥐의 두뇌에 P2X2 C - 터미 너스 네트워크의 이진 proteomic 분석의 도식 표현. GST 비즈에 바운드 GST 단백질과 융합 P2X2 수용체의 C - 말단은 assays 풀다운을 위해 사용되었다. 브레인 lysate 준비되었고 단백질은 재조합 단백질 고정화와 incubated했다. 언바운드 분율은 용해 버퍼로 세탁했다. 단백질은 질량 분광법으로 확인되었습니다.

그림 4. P2X2 수용체의 C - 말단의 바인딩 파트너의 식별. GST (파란색 상자)와 융합 수용체의 C - 말단과 상호 작용하는 단백질 putative의 스펙트럼을 보여주는 Sypro 스테인드 젤. 혼자 혼자 GST (노란색 상자)과 글루타티온 세파 로스 비즈에 대한 컨트롤 차선도 표시됩니다. 화살표 대량 분석법에 의해 더 분석을위한 excised되었습니다 독특한 밴드의 예를 나타냅니다.

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Discussion

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이온 채널은 필수적인 멤브레인 단백질의 주요 클래스입니다. 그들은 선택적으로 플라즈마 막 걸쳐 자신의 전기 그라디언트 아래 이온의 움직임을 허용 물이 가득 모공이 포함되어 있습니다. 개방과 폐쇄 상태 사이의 이온 채널 게이트. 게이팅 단계 P2X의 리간드 게이 티드 이온 채널의 경우에는 송신기 (예 : ATP)에 의해 트리거됩니다, 또는 그것은 다른 단백질과 상호 작용에 의해 규제 수 있습니다. 지난 10 년간은 P2X 수용체가 ATP 13 바인딩하는 방법에 대한 우리의 이해의 증가를 목격하고 있지만 P2X 기능 조절에 보조 단백질의 역할은 덜 잘 이해 남아있다. 이 프로토콜에 설명된 접근 방식은 (첫 단계) C - 말단 세포와 상호 작용하는 단백질을 검사하여 P2X2 수용체에 의해 형성 신호 단지를 식별하도록 설계되었습니다. P2X2 수용체 신호 단지의 전체지도는 이러한 매혹적인 채널의 pathophysiology에 많이 필요한 통찰력을 제공할 것입니다.

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Acknowledgments

SW와 TMV는 국립 보건원에서 NCRR 및 NHLBI 지원합니다. BSK와 HS은 국립 보건원의 NINDS와 NIGMS에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Reagent JT Baker 9829-02
Acrylamide Reagent Bio-Rad 161-0156
Ampicillin Reagent VWR international VW1507-01
Ammonium Bicarbonate Reagent Fluka 09830
Ammonium Persulphate (APS) Reagent Sigma-Aldrich A3678
Adenosine Triphosphate (ATP) Reagent Sigma-Aldrich A7699
Bradford reagent Reagent Bio-Rad 500-0006
Bromophenol blue Reagent Fisher Scientific B-392
Commassie blue R-250 Reagent Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-24972
Dithiotritol (DTT) Reagent EMD Millipore 3860
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Reagent VWR international VW1474-01
Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) Reagent Sigma-Aldrich E8145
Formic acid Reagent EMD Millipore 11670-1
Glutathione Sepharose 4B beads Reagent GE Healthcare 17-5132-01
Hydrochloric acid (HCl) Reagent Sigma-Aldrich H1758
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Reagent Sigma-Aldrich 15502
Iodoacetamide Reagent Sigma-Aldrich I1149
Luria-Bertani (LB) Media Reagent EMD Millipore 1.00547.5007
Leupeptin Reagent Sigma-Aldrich L8511
Lysozyme Reagent Sigma-Aldrich 62971
Magnesium Sulphate (MgSO4) Reagent Sigma-Aldrich S7653
Sodium Chloride (NaCl) Reagent Sigma-Aldrich S3014
Sodium Flouride (NaF) Reagent Sigma-Aldrich S7920
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Reagent Sigma-Aldrich S6508
Nonidet P40 Reagent Fluka 74385
Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) Reagent Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Reagent Sigma-Aldrich S8820
Protein standard Reagent Bio-Rad 161-0305
Sarkosyl Reagent Acros Organics 61207
Screw top vial Tool Agilent Technologies 5182-0866
Sodium dodecyl sulfate Reagent Sigma-Aldrich L4509
SYPRO® Ruby protein gel stain Reagent Bio-Rad 170-3125
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Reagent Sigma-Aldrich T9281
Tris base Reagent Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Reagent Sigma-Aldrich T9284
Trypsin Reagent Promega Corp. V5111
Tween 20 Reagent Sigma-Aldrich P5927
Water Reagent Burdick & Jackson 365-4
LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer Tool Thermo Fisher Scientific, Inc.
Nano Liquid Chromatography System Tool Eksigent
B-Mercapt–thanol Reagent Sigma-Aldrich M6250
Glycerol EMD Millipore GX0185-6

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References

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Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178, doi:10.3791/1178 (2009).More

Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178, doi:10.3791/1178 (2009).

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