Ca उच्च संकल्प के लिए विवरण तरीकों<sup> 2 +</sup> इमेजिंग सहित पृथक अंगों के भीतर चिकनी पेशी के ऊतक, छवि के अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण की तैयारी.
2 Ca + चिकनी पेशी के इमेजिंग सेलुलर तंत्र है कि झिल्ली क्षमता के आंतरिक दुकानों से Ca + 2 की रिहाई के रूप में इस तरह के बदलाव में परिणाम नहीं हो सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, और एकाधिक एक साथ नजर रखी जा कोशिकाओं, उदाहरण के लिए आकलन के लिए अनुमति देता है, में युग्मन syncytial ऊतक. Subcellular Ca 2 + यात्रियों चिकनी पेशी में आम हैं, अभी तक उनके stochastic घटना से देखने का एक बार विस्तृत क्षेत्र पर, कारण एक अंग में समस्याओं की वजह से सही उपाय करने के लिए मुश्किल हैं कि यह अनुबंध करने के लिए प्रवण. इस समस्या पर काबू पाने के लिए, हम इमेजिंग प्रोटोकॉल और विश्लेषण दिनचर्या की एक श्रृंखला के अधिग्रहण और विश्लेषण तो विकसित की है, एक स्वचालित फैशन में, आवृत्ति, और इस तरह की घटनाओं के स्थान आयाम. हालांकि इस दृष्टिकोण के अन्य संदर्भों में लागू किया जा सकता है, हमारे अपने काम का पता लगाने के स्थानीय purinergic Ca 2 शामिल submicron संकल्प के साथ ट्रांसमीटर रिहाई का पता लगाने के लिए यात्रियों +.
एटीपी autonomic नसों, जहां यह detrusor और वीएएस deferens की चिकनी पेशी पर P2X1 रिसेप्टर्स करने के लिए बांध से एक cotransmitter के रूप में जारी है. Ca 2 + चिकनी पेशी में प्रवेश करती है, purinergic neuroeffector Ca 2 + यात्रियों (NCTs) में जिसके परिणामस्वरूप. फोकल Ca 2 + यात्रियों को एक तरह से है कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर कई फायदे है में neurotransmitter रिहाई के ऑप्टिकल निगरानी की अनुमति देते हैं . बहुत सुधार स्थानिक संकल्प के अलावा, ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग एक साथ कई अलग पहचाना साइटों से ट्रांसमीटर रिहाई की रिकॉर्डिंग की अनुमति के अतिरिक्त लाभ है. इसके अलावा, ध्यान की ऑप्टिकल विमान को बनाए रखने के लिए या लंबे समय रिकॉर्डिंग श्रृंखला के दौरान सही से एक intracellular तेज microelectrode के repositioning के है आसान है.
संक्षेप में, 2 Ca + इमेजिंग के प्रतिदीप्ति के लिए एक विधि उल्लिखित है जो ऊतकों की तैयारी, विवरण, और अधिग्रहण और डेटा का विश्लेषण . हम ऐसे Ca 2 + यात्रियों के विश्लेषण के लिए कई लिपियों का उपयोग रूपरेखा .
फ्लोरोसेंट Ca 2 के विकल्प सूचक +
(Ii) 2 CA में शारीरिक परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है + एकाग्रता, ओरेगन 488 BAPTA-1 AM 2 CA के रूप + सूचक चुना गया था क्योंकि यह (मैं) अन्य सामान (जैसे Fluo-4 और कैल्शियम ग्रीन) संकेतक 1 की तुलना में उज्जवल है ग्रीन (iii) भार कई चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, चिकनी पेशी सेल युग्मन के लिए नजर रखी जा सक्षम, intracellular Ca 2 एकाग्रता + [ca 2 +] मैं (वीएएस के जैसे deferens 2) के लिए इसी तरह की एक परिमाण के एक कश्मीर घ के साथ हालांकि, ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1 AM एक गैर – ratioable Ca 2 + सूचक है, और इस तरह के रूप में आसानी से नहीं हो निरपेक्ष निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. [2 Ca +] मैं. इसके अलावा, यह भी Ca 2 + यदि वर्तमान उच्च सांद्रता में बफर कर सकते हैं और [2 Ca +] मैं उच्च आयाम में परिवर्तन के साथ संतृप्त हो जाता है.
सहज सिकुड़ना के निषेध
चिकनी मांसपेशियों अंगों की सहज सिकुड़ना pharmacologically कम किया जा सकता है, जैसे दो Ca + + एल प्रकार Ca के माध्यम से 2 चैनल (उदाहरण के द्वारा: तीन nifedipine, diltiazem 4) आंदोलन अवरुद्ध द्वारा. नोट है कि इन दवाओं बहुत के आयाम पूरे सेल Ca 2 + / चमक यात्रियों कम हो जाएगा .
वीएएस के संकुचन मुख्य रूप से purinergic और noradrenergic neurotransmission का एक संयोजन से परिणाम deferens. फोकल 2 Ca + यात्रियों में इस ऊतक हैं, तथापि, noradrenergic रिसेप्टर नाकाबंदी (जैसे α एक adrenoceptor, prazosin 5) तो आंदोलन फोकल Ca दो यात्रियों + को प्रभावित किए बिना कम किया जा सकता है के लिए असंवेदनशील है.
वैकल्पिक रूप से, संकुचन 6 wortmannin द्वारा मायोसिन प्रकाश श्रृंखला kinase उदाहरण के निषेध के माध्यम से 'अनुप्रवाह' रोका सकता है.
निष्कर्ष
Submicron संकल्प Ca + प्रतिदीप्ति 2 निगरानी neurotransmitter रिहाई 5,7 के बाद junctional प्रभाव का अध्ययन करने और Ca 2 की रिहाई + आंतरिक स्टोर (जैसे 'स्पार्क्स 8) से एक शक्तिशाली तकनीक है. Ca 2 के विश्लेषण + पद्धति का उपयोग कर यात्रियों को यहाँ उल्लिखित वाणिज्यिक छवि विश्लेषण उपलब्ध संकुल की तुलना में लागत प्रभावी है और कस्टम लिखा ImageJ के लिए जावा plugins के माध्यम से दर्जी विश्लेषण की अनुमति देता है है.
The authors have nothing to disclose.
The Wellcome Trust provided financial support (VIP Award to J.S.Y. and 074128 Research Fellowship to K.L.B.). Medical Research Council Studentship to R.J.A.
Leica_SP2_Stacker, an algorithm used to import TIFFs for ‘reconstruction’ into a series, is based on Leica_tiff_sequence, a plugin for reading Leica SP2 TIFFs in ImageJ, developed by Tony Collins and used with his permission.
(http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html)StackReg and TurboReg, algorithms used to correct for movement of tissue, are based on Th venaz and colleagues (1998)9.
Excel_writer.jar was written by Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html).
JNCT0.08JoVE.ijm, the particle detection algorithm, is based on an algorithm written by K.L. Brain and detailed previously5.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg | |
Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO | |
Leica SP2 upright confocal microscope | Leica | |||
Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport | M-VW-3046-OPT-012140 | ||
Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |