高分辨率CA的详细信息的方法<sup> 2 +</sup>成像在孤立的器官,包括平滑肌组织,图像采集和数据分析的准备。
的Ca 2 +平滑肌的成像提供进入细胞的机制,可能无法导致膜电位的变化,如从内部存储的Ca 2 +释放,的洞察力,并允许同时监控多个单元格,例如,评估,耦合合胞体组织。亚细胞的Ca 2 +瞬变共同平滑肌,但因为他们随机发生的看法往往是广泛的领域,造成的问题,器官,难以准确衡量,它容易产生合同。为了克服这个问题,我们已经开发了一系列的成像协议和分析程序的收购,然后分析,以自动方式,频率,此类事件的位置和幅度。虽然这种方法可应用在其他情况下,我们自己的工作,涉及当地嘌呤钙的检测,定位与亚微米分辨率的递质释放的瞬变。
从cotransmitter植物神经,它结合P2X1受体对逼尿肌和输精管的平滑肌ATP释放。 钙离子进入平滑肌,造成嘌呤neuroeffector的Ca 2 +瞬变(NCTS)。协调中心的Ca 2 +瞬变允许的方式,对电的诸多优势中的神经递质释放的光学监测。除了大大提高了空间分辨率,光学记录允许从许多同时分辨网站的记录递质释放的额外优势。此外,光学平面的重点是更容易保持正确或在长时间录音系列比细胞内的尖锐的微电极的重新定位。
总之,概述的Ca 2 +荧光成像的方法,详细介绍了组织准备,数据的采集和分析。我们概括了几个剧本, 如钙瞬变分析使用。
荧光灯的Ca 2 +指示剂的选择
俄勒冈州的绿488 BAPTA凌晨1点被选择的Ca 2 +指示剂 ,因为它(我)是光明的,相比其他指标(如氟- 4和钙绿 )1,(ii)是敏感的生理变化, 在Ca 2 +浓度一个类似规模的1细胞内的Ca 2 +浓度的[Ca 2 +] I(VAS如输精管2)K D;(三)加载许多平滑肌细胞,使平滑肌细胞的耦合进行监测。不过,俄勒冈州绿488 BAPTA – 1上午是一个非ratioable的Ca 2 +指示剂 ,因此不能轻易地被用来确定绝对的[Ca 2 +] i的。此外,它也可能缓冲的Ca 2 +如果存在高浓度,并成为高振幅变化的[Ca 2 +] i的饱和。
自发性收缩的抑制作用
自发收缩平滑肌机关可能减少,如药理,通过阻断运动的Ca 2 +通过L型Ca 2 +通道(例如通过:硝苯地平,地尔硫4)。请注意,这些药物将大大降低全细胞的Ca 2 +闪烁/瞬变的幅度。
输精管收缩输精管主要是嘌呤和去甲肾上腺素能神经递质结合的结果。然而,焦距的Ca 2 +在这个组织中的瞬变,去甲肾上腺素受体 阻断剂(如α1受体,哌唑嗪 5),这样的运动可减少不影响焦距的Ca 2 +瞬变不敏感。
另外,可能被阻止收缩,“下游”,通过抑制肌球蛋白轻链激酶如渥曼青霉素6。
结论
在亚微米分辨率的Ca 2 +荧光监测,是一个功能强大的技术来研究神经递质的释放5,7后交界的影响和释放的Ca 2 +从内部商店(如“ 火花 ”8 )。分析的Ca 2 +瞬变的使用方法这里列出的成本效益比市售的图像分析软件包,可以通过自定义编写的Java插件ImageJ度身订造的分析。
The authors have nothing to disclose.
威康信托基金会提供财政支持(贵宾奖JSY和074128研究奖学金KLB)。医学研究理事会助学金,以RJA
Leica_SP2_Stacker,用于进口“重建”成系列的TIFF的算法,是基于Leica_tiff_sequence,读他的许可徕卡SP2的TIFF格式,由托尼柯林斯开发和使用在ImageJ插件。
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html )StackReg和TurboReg,用正确的组织运动的算法,是基于钍venaz和他的同事(1998)9 。
Excel_writer.jar写由Kurt德沃斯(http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html)。
JNCT0.08JoVE.ijm,粒子探测算法,是基于书面吉隆坡脑,以前5详细的算法。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg | |
Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO | |
Leica SP2 upright confocal microscope | Leica | |||
Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport | M-VW-3046-OPT-012140 | ||
Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |