Detaljer metoder för högupplösta Ca<sup> 2 +</sup> Avbildning av glatt muskulatur i isolerade organ, inklusive: förberedelse av vävnad, bild förvärv och dataanalys.
Ca 2 +-avbildning av glatt muskulatur ger en inblick i cellulära mekanismer som inte kan resultera i förändringar av membran potential, som t.ex. frisläppandet av Ca2 + från interna affärer, och gör att flera celler som skall övervakas samtidigt för att bedöma till exempel koppling i syncytial vävnad. Subcellulära Ca 2 + transienter är vanliga i glatt muskulatur, men är svåra att mäta exakt på grund av de problem som orsakas av deras stokastisk händelse, över en ofta brett synfält, i ett organ som det benägna att ingå avtal. För att lösa detta problem har vi utvecklat en serie avbildning protokoll och rutiner analys för att förvärva och sedan analysera, på ett automatiserat sätt, hur ofta, plats och amplitud av sådana händelser. Även om detta tillvägagångssätt kan tillämpas i andra sammanhang, innebär vårt arbete att upptäcka lokala Purinergic Ca2 + transienter för att lokalisera sändare utgivning med submicron upplösning.
ATP är utsläppt som en cotransmitter från autonoma nerver, där den binder till P2X1 receptorer på den glatta muskulaturen i detrusor och sädesledaren. Ca 2 + kommer in i glatt muskulatur, vilket resulterar i Purinergic neuroeffector Ca 2 + transienter (NCTS). I fokus Ca 2 + transienter gör den optiska övervakningen av signalsubstansen ut på ett sätt som har många fördelar jämfört med elektrofysiologi. Bortsett från de mycket bättre rumslig upplösning, har optisk inspelning den ytterligare fördelen att inspelningen av transmittorfrisättning från många urskiljbara platser samtidigt. Dessutom är den optiska planet i fokus lättare att underhålla eller korrigera under lång inspelning serien än vad ompositionering av en intracellulär vassa mikroelektrod.
Sammanfattningsvis är en metod för avbildning av Ca 2 + fluorescens anges som specificerar framställning av vävnad, och förvärvet och analys av data. Redogör vi för användning av flera skript för analys av sådana Ca 2 + transienter.
Val av fluorescerande Ca 2 +-indikatorn
Oregon Grön 488 BAPTA-1:00 valdes som Ca 2 + indikator, eftersom det (i) är ljus jämfört med andra indikatorer (t.ex. Fluo-4 och Kalcium grön) 1, (ii) är känslig för fysiologiska förändringar i Ca 2 + koncentrationen med ett K D i samma storleksordning 1 till intracellulära Ca 2 + koncentrationen [Ca 2 +] i (t.ex. av sädesledare 2), (iii) belastning många glatta muskelceller, vilket möjliggör smidig muskelcellen koppling som skall övervakas. Det är dock Oregon Grön 488 BAPTA-1 är en icke-ratioable Ca 2 + indikator, och som sådan kan inte enkelt användas för att bestämma den absoluta [Ca 2 +] i. Dessutom kan det buffert även Ca2 + om den finns i höga koncentrationer och blir mättat med hög amplitud förändringar i [Ca2 +] i.
Hämning av spontana kontraktilitet
Den spontana kontraktilitet i glatt muskulatur organ kan minskas farmakologiskt, t.ex. genom att blockera flödet av Ca 2 + genom L-typ Ca2 +-kanaler (t.ex. genom att: nifedipin 3, diltiazem 4). Observera att dessa läkemedel avsevärt kommer att minska amplituden av helcells-Ca 2 + blixtar / transienter.
Sammandragning av sädesledaren resultatet av en kombination av i första hand Purinergic och noradrenerga neurotransmissionen. Fokal Ca2 + transienter i denna vävnad är dock okänslig för noradrenerga receptor blockad (t.ex. α 1-receptorn, med prazosin 5), så rörelse kan minskas utan att påverka centrala Ca2 + transienter.
Alternativt kan kontraktion förhindras "nedströms" genom hämning av myosin lätta kedjan kinas t.ex. genom wortmannin 6.
Slutsatser
Övervakning av Ca 2 + fluorescens vid submicron resolution är en kraftfull teknik för att studera efter Junktional effekterna av signalsubstansen frigöra 5,7 och frisättning av Ca 2 + från interna affärer (t.ex. "gnistor" 8). Analysen av Ca 2 + transienter enligt den metod som beskrivs här är kostnadseffektivt jämfört med kommersiellt tillgängliga bildanalys paket och möjliggör skräddarsydda analys genom skräddarsydda skriven Java-plugins för ImageJ.
The authors have nothing to disclose.
Wellcome Trust gett ekonomiskt stöd (VIP Award till JSY och 074.128 forskartjänst till KLB). Medicinska forskningsrådet utbildningsbidrag till RJA
Leica_SP2_Stacker, en algoritm som används för att importera TIFF för "rekonstruktion" i en serie, är baserad på Leica_tiff_sequence, en plugin för att läsa Leica SP2 TIFF i ImageJ, som utvecklats av Tony Collins och används med hans tillåtelse.
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg och TurboReg, algoritmer används för att korrigera för förflyttning av vävnad, baserat på Th venaz och kollegor (1998) 9.
Excel_writer.jar skriven av Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html).
JNCT0.08JoVE.ijm, partikeln upptäckt algoritm är baserad på en algoritm skriven av KL Brain och detaljerade tidigare 5.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg | |
Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO | |
Leica SP2 upright confocal microscope | Leica | |||
Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport | M-VW-3046-OPT-012140 | ||
Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |