酸性α-膨大诱导测量植物细胞壁扩展（蠕变）

Summary

我们证明一个恒定的力量引伸来衡量长期，延长植物细胞壁标本（蠕变）酸性缓冲区和膨大蛋白质引起的。

Abstract

日益严重的植物细胞壁的特征表现为“酸的增长”，我们的意思，他们是在低pH值^（<5）1更具可扩展性着称的属性。植物激素生长素迅速刺激至少有一部分细胞伸长酸增长机制^，2，3，幼茎和类似组织。生长素激活的H ⁺泵的质膜，造成细胞壁溶液酸化。长城酸化激活expansins，这是内源性的细胞壁松^蛋白 4，导致细胞壁产生细胞膨压在墙壁上创建的紧张局势。因此，细胞开始迅速放大。这“酸增长”的现象很容易测量隔离（非生物）细胞壁标本。细胞壁的能力进行酸诱导延伸不是单纯的细胞壁多糖（如果胶）的结构安排的结果，而是取决于^活动 expansins 5。 Expansins没有任何已知的酶的活性，并检测膨大活动的唯一途径，是衡量其细胞壁扩展的感应。这个视频报告的细节膨大实验获得合适的墙体材料的来源和制备技术及酸诱导的延伸和膨大诱导墙样品准备种植黄瓜下胚轴的延伸。

要获得适当的细胞壁样品，黄瓜幼苗在黑暗中生长，胚轴削减和冻结在-80 ° C。冷冻胚轴磨损，夷为平地，然后在引伸计测量的一个特殊的比色皿的恒张力夹紧。为了测量酸诱导的延伸，墙壁最初在中性pH缓冲，导致在低活动expansins本地细胞壁的组成部分。当酸性pH值的缓冲液交换，ex​​pansins被激活和细胞壁迅速扩大。我们也证明了一个重组实验膨大活动。对于这部分，我们使用一个简短的热处理，在细胞壁样变性的原生expansins。这些灭活的细胞壁不延长，甚至在酸性的缓冲，但除了细胞壁expansins迅速恢复他们的能力，延长。

Protocol

第1部分：成长和存储合适的植物材料

1. 根据我们的经验，年轻的黄化黄瓜幼苗下胚轴作为这些实验的细胞壁物质来源方便。黄瓜种子播种在湿纸在避光盒子，里面是在黑暗的内阁保持在设定房间温度恒定在26 ° C。精确的温度并不重要，为22 °和30 °之间的任何C应被罚款，但温度将决定如何快速苗达到一个适当的发展阶段。温暖的温度，更快的幼苗发展。我们通常使用时，他们已发展到约5厘米的长度，达到播种后3-4天的幼苗。重要的是，在黑暗中生长的幼苗，即使少量的光，影响幼苗发育率和细胞壁的特性，我们衡量这项技术。第3天，你可以窥视在框中，使用过滤光线暗淡的绿色，幼苗发育检查。
2. 幼苗迅速削减和小塑料盒，每盒100-150苗包装，并储存在-80 ° C在此温度下，他们仍然有用的几个星期。

第2部分：准备细胞壁样本

1. 从冰箱中冷冻切苗的小团体（8-10）被转移到一个绝缘容器-80冷冻块。
2. 角质层覆盖下胚轴是用金刚砂打磨。这是通过反复绘图之间的拇指和食指，这是涂厚浆的湿碳化硅粉末胚轴。这需要一些经验，知道使用正确的压力：压力太大，表皮层开始分解并撕裂;太少的压力，将不透的角质层。也有迅速开展工作，因为胚轴的冷冻解冻，弛缓性和难以管理。
3. 磨损胚轴浸泡在冰水中删除最坚持碳化硅和存储在冰水然后准备以类似的方式，而其余胚轴。
4. 的下胚轴切到所需长度，通常为1.2厘米，与一个新的单刃刀片，然后在玻片上保持一致。
5. 现在，我们需要拼合的墙，去除细胞SAP和促进夹紧。第二个载玻片放在8-10样本组顶部，形成一个三明治。 5分钟的载玻片上放置一个重量（400-500克）。为重，我们经常使用含有适量的水的烧杯中。
6. 可选步骤：根据实验，下胚轴可能在这一点上简短的热处理灭活。要做到这一点，我们结合玻片连同一副橡皮筋，把100毫升去离子水大会在室温下在一个容器中，并将其放置在在满功率的微波炉。随着我们的微波炉在50秒左右的水开始沸腾，我们停止微波15秒，煮沸后开始。热水迅速浇灭了，用冷水代替停止变性。您可能必须更改这些时间，您的微波可能比我们的不同。过度加热的样本变弱和容易折断。随着加热不足，是不是灭活内源性膨大和墙上的样品保留一些酸性pH值的响应。

第3部分：引伸设置

1. 墙上的样品，现在夹在一个恒定的力量引伸。这是一个定制的设备，树脂玻璃比色皿的一个组成控股皮基底墙样本和样品的顶端连接到一个可移动的钳位。可移动的夹具上安装，通过开放式位置传感器线圈通过一杆结束，LVDT或“线性可变差动变压器，电子检测到一个小的金属圆柱体的位置，或”核心“，即附着杆。杆的上端是一个可调节配重的杠杆。这杆施加向上的力的可调墙壁上的样本量。力调整，通过添加或删除校准的金属重物，杠杆的尽头。
2. 回到墙上的样品 - 胚轴样品的基础到底是用细镊子和根尖结束〜2-3毫米之间的可移动钳开放颌骨拾起。这钳是一个弹簧加载的鳄鱼钳的金属涂塑颌骨之间，以防止直接接触的金属表面与缓冲溶液或墙上的样品。根据我们的经验金属离子可以从钳位利奇和抑制墙上的能力，延长，所​​以我们保持金属覆盖。
3. 一方面控股的移动式钳大会，墙上的标本皮基底是目前机动铰链之间的两件树脂玻璃比色皿和试管片断汇集，并拧紧，从而锁定在试管底墙样品。
4. 移动式钳大会现在轻轻的释放，使全部力量的平衡力被转移到墙上的标本。我们经常使用的总配重20克墙样品准备从黄瓜下胚轴。其他墙体材料或实验可能需要不同的权重。
5. 试管充满缓冲液（200 UL）和试管的位置移动或向下调整螺丝，使移动式钳LVDT测量范围的低端。我们的LVDT连接的微机数据采集单元，所以我们通过计算机监控LVDT位置。我们有八个并行连接一台电脑，这使得我们可以同时运行8墙样本的LVDT的集会。电脑记录的每一次30秒的LVDT集会的位置

第4部分：测量扩展响应酸的pH值或膨大 - 代表性的结果

1. [实验]用于测量酸诱导的延伸，我们开始与本地墙样品（即不与热灭活）和中性缓冲添加到试管中。墙上的样品延长了几分钟，增加紧张，但扩展衰变后几分钟率较低。我们的电脑可以让我们监控样品长度的变化（也就是说，在可移动夹具的位置的变化，在实验开始后，），或者我们可以监测时间导数的位置，换句话说，延伸率。延伸率稳定与时间价值低。
2. 〜20分钟后，中性缓冲被删除。我们用薄的金属管，从大规格注射针，迅速清除缓冲区，以最小的干扰墙壁或机械装配，连接真空泵。酸性缓冲液，然后补充说，有时1-2快速交流，以确保完整的交流酸性缓冲。然后我们坐视墙上的反应。通常情况下，我们可以在几分钟内检测的速度扩展。 60分钟后，我们通常有足够的信息来评估扩展响应，虽然在某些情况下测量可延伸至更长的时间。
3. [第二个实验]膨大诱导细胞壁扩展的测量，我们与热灭活墙样品和酸性缓冲开始被添加到试管。在第一个实验中，细胞壁的延伸率逐渐稳定到低价值，因为缺乏功能膨大。
4. 〜20分钟后，膨大的蛋白质添加到试管“扣球”与试管中的缓冲区10-20 UL膨大的解决方案。膨大迅速穿透细胞壁的样品，并在几分钟之内，我们看到，延伸率有所提高。这个扩展的反应可以遵循一个小时或更长时间。

图1：准备细胞壁评估酸诱导或膨大诱导墙扩展的程序的大纲。

Discussion

对于本演示中，我们用黄瓜下胚轴细胞壁，因为他们已经被证明是一个可靠的来源，很容易处理，并具有良好的灵敏度，响应墙样品。我们也有过良好的成功与其他树苗以及一些材料从超市，如年轻的菠菜叶和芹菜，墙壁。基本上，年轻，柔软，生长迅速的植物组织有可能使用这种技术可以很容易地测量，但坚韧，老，氧化或nongrowing的植物组织都不太可能因为细胞壁交联反应。有一些其他的东西，要提防：

1. 生物变异 - 甚至是统一的苗木给变量的反应，所以至少5-8复制是必要的收益率在统计上有意义的结果。
2. 重要的是要允许缓冲区和蛋白质的细胞壁标本迅速渗透角质层磨损。如果角质层没有足够的磨损，酸性缓冲区的反应将是缓慢和静音和蛋白质甚至可能无法穿透角质层引起响应。有些样品可能不需要磨损，即，如果您使用表皮果皮或其他解剖组织。不均匀磨损，增加了许多新手的重大变化。
3. 热失活，这是用来删除或变性，内源性expansins的，可以通过其他方法进行，但需要找到少量加热灭活内源性膨大，以避免过多的削弱和墙上的样品破损。
4. Expansins很容易被氧化失活，所以1-5毫米的缓冲区二硫苏糖醇通常有助于稳定的活动。
5. 引伸不关闭的，现成的一件装备，但需要自定义（一）持有墙上的标本和（二）将LVDT钳抗衡大会试管建设。计算机接口和数据采集单元是没有必要的，但同时运行复制样品和定量分析扩展曲线，特别是有价值的。