Summary
우리는 산성 버퍼와 expansin 단백질에 의해 유도된 식물 세포 벽의 표본의 장기 연장 (크리프)를 측정하기 위해 일정한 - 강제 신장계의 사용을 보여줍니다.
Abstract
성장 식물 세포 벽 특질상 우리가 그들이 낮은 PH (<5) 1에서 더 확장 의미하는 '산성의 성장'으로 알려진 속성을 나타냅니다. 식물 호르몬 옥신은 급격히 산성 성장 메커니즘 2, 3 적어도 일부 젊은 줄기 및 유사 조직의 세포 신장을 자극. 옥신은 H를 활성화 + 플라즈마 막에 펌프를, 세포 벽 솔루션의 산성화을 불러 일으킨다. 벽면 산성화은 세포 벽이 셀 turgor 압력에 의해 만들어진 벽면 긴장에 항복로 인해, 내생 세포 벽 - 느슨해진 단백질 4아르 expansins를 활성화됩니다. 그 결과, 세포가 급속하게 확대하기 시작합니다. 이 '산성 성장'현상이 쉽게 격리 (nonliving) 세포 벽 표본 단위로 측정됩니다. 산성 유도 확장자를 받아야하는 세포 벽의 능력은 단순히 세포 벽의 다당류 (예 : pectins)의 구조 배열의 결과 아니라, expansins 5 활동에 따라 달라집니다. Expansins은 알려진 효소 활동을하지 않으며 expansin 활동에 대해 분석하는 유일한 방법은 세포 벽 확장 자신의 유도를 측정하는 것입니다. 이 비디오 보고서는 세부 expansin의 assays에 적합한 벽 자료를 얻기위한 소스와 준비 기술과 산성 유발 확장 및 성장 오이 hypocotyls에서 준비 벽 샘플 expansin 유발 확장을 보여주기에갑니다.
적당한 세포 벽 샘플을 얻으려면, 오이 모종이 어둠 속에서 재배, hypocotyls가 -80에서 잘라 냉동 ° C. 냉동 hypocotyls는 abraded 평평하고 신장계 측정을위한 특별한 쿠베트에 일정한 장력에 고정되어 있습니다. 산성 유도 확장을 측정하려면 벽은 처음에 기본 셀 벽면의 구성 요소 expansins의 낮은 활동의 결과, 중성 산도에서 버퍼입니다. 산성 산도에 버퍼 교환시 expansins가 활성화하고 세포 벽이 급속하게 확장하고 있습니다. 우리는 또한 reconstitution 분석에 expansin 활동을 보여줍니다. 이 부분에 대한, 우리는 세포 벽 샘플에서 네이티브 expansins을 변성하는 간단한 열처리를 사용합니다. 이러한 inactivated 세포 벽 산성 버퍼에도 확장할 수 없지만, 세포 벽에 expansins의 또한 급속하게 확장하는 능력을 복원합니다.
Protocol
1 부 : 재배와 적합한 식물 자료를 저장
- 우리의 경험에서 etiolated 오이 모종의 젊은 hypocotyls이 실험을 위해 세포 벽 재료의 편리한 소스로 제공하고 있습니다. 오이 씨앗 26에서 설정한 일정한 온도 룸에서 어두운 캐비닛에 보관되는 빛을 증거 상자 ° C.에 서부 유럽 표준시 종이에 sown 아르 C가 괜찮을 20 °와 30 ° 사이에 아무것도로 정확한 온도가 중요한 것은 아니지만 온도가 묘목 개발의 적절한 단계에 도달 얼마나 빨리 결정됩니다. 따뜻한 온도, 빨리 묘목이 개발합니다. 그들은 파종 후 3-4일에 도달 길이 약 5cm로 성장 할 때 우리는 일반적으로 모종을 사용합니다. 빛의 심지어 소량 우리가이 기술을 측정되는 묘목 개발의 속도와 세포 벽 특성 모두에 영향을 미칠 때, 묘목이 어둠 속에서 성장하는 것이 중요합니다. 일 3 당신은 세들링 개발에 확인, 희미한 녹색 빛 필터링을 사용하여 상자에 살짝 수 있습니다.
- 모종 신속하게 절단하고 작은 플라스틱 상자, 상자 당 100-150 모종의 포장하고, -80 ° C.에 저장됩니다 이 온도에서 그들은 몇 주 동안 유용하게 남아있다.
2 부 : 준비 셀 벽 샘플
- 냉동 컷 모종의 소그룹 (80-10)은 냉동고에서 -80 냉동실 블록을 포함하는 절연 컨테이너로 전송됩니다.
- hypocotyl를 덮고 표피는 카보런덤와 abraded 있습니다. 이것은 반복 서부 유럽 표준시 카보런덤 분말의 굵은 슬러리와 코팅의 엄지와 집게손가락 사이 hypocotyl를 그림으로써 이루어집니다. ; 너무 작은 압력과 표피가 permeabilized되지 않습니다 너무 많은 압력과 표피 레이어가났습니다하고 찢어진 것으로 시작 : 그것은 사용 압력의 정확한 금액을 알고 조금 경험이 걸립니다. 하나는 또한 냉동 hypocotyl 녹아서, 그것이 관리 이완된 및 하드되어 있기 때문에 신속하게 작업합니다.
- 나머지 hypocotyls가 유사한 방식으로 준비하는 동안 abraded hypocotyl는 얼음물에 저장된 후 준수 카보런덤와의 대부분을 제거하는 얼음물에 담근이다.
- hypocotyls는 새로운 하나의 양날 면도날로, 원하는 길이, 보통 1.2 cm로 절단하고 유리 슬라이드에 정렬됩니다.
- 이제 우리는 세포 수액을 제거하고 클램핑 촉진하기 위해 벽면을 평평하게해야합니다. 두 번째 유리 슬라이드는 샌드위치를 형성 8-10 샘플 그룹의 상단에 위치합니다. 무게 (400~500그램)는 5 분 유리 슬라이드 위에 위치합니다. 무게 위해 우리는 정기적으로 물을 적절한 금액을 포함하는 비커를 사용합니다.
- 선택 단계 : 실험에 따라 hypocotyls이 시점에서 간단한 열처리로 inactivated 수 있습니다. 이렇게하려면 우리는 유리가 고무 밴드의 한 쌍을 함께 슬라이드를 바인드 실온에서 드 이온화 물 100 ML있는 용기에 어셈블리를 넣고 전체 전력에서 전자렌지에 넣습니다. 우리 전자렌지로 물이 약 50 S에서 끓기 시작하고 끓는이 시작 후 우리는 전자 레인지 15 S를 중지합니다. 온수는 빠르게 해제 붓고 및 변성을 막을 찬물로 대체됩니다. 귀하의 전자 레인지가 우리와 다를 수 있습니다대로,이 타이밍을 변경할 수 있습니다. 과도한 난방과 샘플이 약하되어 쉽게 휴식. 충분한 가열과 내생 expansin는 inactivated과 벽면 샘플 산성 pH의 몇 가지 대응을 유지하지 않습니다.
파트 3 : 신장계 설정
- 벽 샘플은 현재 지속적인 강제 신장계에 고정되어 있습니다. 이것은 벽에 샘플과 샘플의 꼭대기의 끝에 붙어 움직일 수있는 클램프의 기초 끝을 잡고위한 플렉시 쿠베트 구성된 맞춤식 장치입니다. 움직일 수있는 클램프가 위치 센서의 오픈 코일 통과 막대의 끝 부분에 탑재, LVDT 또는 전자 작은 금속 실린더의 위치를 감지 '선형 가변 차동 변압기', 또는 '핵심'입니다 막대에 연결된. 막대의 위쪽 끝을 조절 평형추있는 레버에 연결되어 있습니다. 이 레버는 벽에 샘플에서 위쪽으로 힘을 조절 금액을 미치는. 힘이 레버의 맨 끝에 조정 금속 무게를 추가하거나 제거하여 조정됩니다.
- 위로 벽면 예제 - hypocotyl 샘플의 기초 끝을 잘 포셉과 혀끝의 끝에 ~ 2~3mm이 움직일 수있는 클램프의 오픈 문턱 사이에 위치로 체포됩니다. 이 클램프 누구의 금속 문턱이 금속 표면과 버퍼 솔루션이나 벽에 샘플 사이의 직접 접촉을 방지하기 위해 플라스틱과 코팅하는 용수철 악어 클램프입니다. 우리의 경험 금속 이온에 연장, 그래서 우리는 금속이 적용 유지 벽의 능력을 발휘 클램프의 리치가 수있다.
- 한 손으로 움직일 수있는 클램프 어셈블리를 개최, 벽 시편의 기초 끝에 이제 플렉시 쿠베트과 쿠베트의 두 기복 조각 사이 였는데입니다조각이 함께 가져온시키고 쿠베트의 벽 샘플의 바닥 끝을 잠금, 꽉 망했다.
- 움직일 수있는 클램프 어셈블리 이제 부드럽게 평형의 전체 힘이 벽에 표본로 전송 있도록 배포되고 있습니다. 우리는 일상적으로 오이 hypocotyls에서 준비 벽 샘플 20g 총 평형추을 사용합니다. 기타 벽 자료 또는 실험 서로 다른 가중치를 필요로 할 수도 있습니다.
- 쿠베트는 버퍼가 가득 (200 UL)과 쿠베트의 위치는 움직일 수있는 클램프가 LVDT 측정 범위의 하단에 회부되도록, 조정 나사와 함께 아래로 이동하거나합니다. 우리 LVDT는 마이크로의 데이터 수집 장치에 연결하고, 그래서 우리는 컴퓨터를 통해 LVDT 위치를 모니터입니다. 우리는 동시에 8 벽에 샘플을 실행할 수 있습니다 하나의 컴퓨터와 병렬로 연결 팔 LVDT 어셈블리 있습니다. 컴퓨터는 매 30 S. 한번 LVDT 어셈블리의 각각의 위치를 기록
4 부 : 산성 산도 또는 expansin로 측정 확장 응답 - 대표 결과
- [첫 번째 실험] 산성 유발 연장의 측정을 위해, 우리는 기본 벽 샘플 (즉, 열과 inactivated되지 않습니다)과 중성 버퍼로 시작은 쿠베트에 추가됩니다. 벽면 샘플 추가 긴장에 대응, 몇 분 동안 연장하지만, 확장 자연 붕괴 몇 분 후에 낮은 요금합니다. 우리 컴퓨터는 우리가 어느 샘플의 길이의 변화 (즉 실험의 시작 후 움직일 수있는 클램프의 위치의 변화입니다) 모니터 또는 우리가 즉, 확장의 속도를 위치의 시간 유도체를 모니터링할 수 있습니다 . 확장 속도는 시간과 낮은 값을 안정화.
- ~ 20 분 후, 중립 버퍼가 제거됩니다. 우리는 벽에 최소한의 방해 또는 기계 조립과, 빨리 버퍼를 제거하는 진공 펌프에 연결된 대형 게이지 피하 바늘로 만든 얇은 금속 파이프를 사용합니다. 산성 버퍼는 다음 산성 버퍼의 전체 교환을 확보하기 위해 1-2 신속한 교류로 때로는 추가됩니다. 그렇다면 우리는 앉아서 벽의 반응을 봐. 일반적으로 우리는 몇 분 안에 확장의 빠른 속도를 검색할 수 있습니다. 어떤 경우에 측정이 더 이상 기간을 연장할 수 있지만 60 분 후에 우리는 일반적으로, 확장 반응을 평가하기 위해 충분한 정보를 얻을 수있다.
- [두번째 실험] expansin 유발 세포 벽 확장의 측정을 위해, 우리는 열을 inactivated 벽 샘플 산성 버퍼로 시작은 쿠베트에 추가됩니다. 첫 번째 실험과 마찬가지로, 세포 벽 확장의 속도가 점차 때문에 기능 expansin 부족의 낮은 값으로 안정.
- ~ 20 분 후, expansin 단백질은 expansin 솔루션의 10-20 UL과 쿠베트에서 버퍼와 '급상승'에 의해 쿠베트에 추가됩니다. expansin는 빠르게 세포 벽 샘플을 관통하고 몇 분 이내에 우리는 확장 률이 증가했습니다 것을 볼 수 있습니다. 이 확장 응답 시간 이상 다음 수 있습니다.
그림 1 : 산성 유발 또는 expansin 유발 벽을 확장을 평가하기 위해 세포 벽 준비 절차의 개요.
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Discussion
그들이 처리하고 좋은 감도와 반응하기 쉬운 벽 샘플의 신뢰할 수있는 원본으로 입증해야하기 때문에이 실험을 위해 우리는 오이 hypocotyls의 세포 벽를 사용했습니다. 우리는 또한 어린 시금치 잎과 셀러리 줄기로 슈퍼마켓에서 다른 모종뿐만 아니라 재료에서 벽 좋은 성공을 있었다. 기본적으로, 젊고 부드럽고 빠르게 성장하는 식물의 조직이 쉽게이 기술을 측정 가능성이 있지만, 거친, 이전, 산화 또는 nongrowing 식물 조직 때문에 세포 벽이 교차 연결의 반응이 될 가능성이 있습니다. 주의 할 몇 가지 다른 것들이 있습니다 :
- 생물 다양성 - 심지어 균일한 모종이 변수 응답을 제공하므로 5-8의 최소 복제는 통계적으로 의미있는 결과를 얻을 필요가 있습니다.
- 표피의 마모가 세포 벽에 표본으로 버퍼 및 단백질의 빠른 침투력을 허용하는 것이 중요합니다. 표피가 충분히 abraded되지 않은 경우, 산성 버퍼에 대한 답변은 느리고 음소거되고 단백질도 응답을 이끌어내는 수있는 표피를 뚫고하지 않을 수 있습니다. 당신은 표피 껍질이나 다른 해부 조직을 사용하는 경우 일부 샘플은 마모, 즉 필요하지 않을 수도 있습니다. Nonuniform의 마모는 많은 초보자를위한 중대한 다양성을 추가합니다.
- 내생 expansins를 제거하거나 변성하는 데 사용되는 열 불활 성화는, 다른 방법에 의해 실시 수있는,하지만 그 중 하나 요구 벽 샘플 과도한 약화 및 파손을 피하기 위해 내생 expansin를 inactivate하는 난방의 최소한의 금액을 찾을 수 있습니다.
- Expansins는 산화에 의해 불활 성화하는 경향이 있으며, 버퍼에 이렇게 1-5 MM의 dithiothreitol은 일반적으로 활동을 안정화하는 데 도움이됩니다.
- 신장계 장비의 재고품의 기사는 아니지만 벽에 표본 및 (b) LVDT - 클램프 - 평형추 어셈블리를 보유 (A) 쿠베트의 정의 건설이 필요합니다. 컴퓨터 인터페이스와 데이터 수집 장치는 필수적인 것은 아니지만 동시에 복제 샘플을 실행과 양적 확장 곡선을 분석에 특히 유용합니다.
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Acknowledgments
여기에 표시된 기술은 에너지학과 (Bioenergy 과학)에서 보조금과 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 자금과 개발되었습니다.
References
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