Celda de medición Planta de Extensión de la pared (creep) inducida por el pH ácido y por Alfa-expansina

Summary

Se demuestra el uso de un extensómetro de fuerza constante a medida a largo plazo de extensión (fluencia) de especímenes de plantas de la pared celular inducida por tampones ácidos y proteínas expansina.

Abstract

Cada vez las paredes celulares vegetales típicamente presentan una propiedad conocida como "el crecimiento de ácido, por lo que entendemos que es más extensible a un pH bajo (<5) ^1. La hormona auxina planta rápidamente estimula la elongación celular en los tallos jóvenes y los tejidos similares al menos en parte por un mecanismo ácido-crecimiento del ^{2, 3.} Auxina activa una bomba de H ⁺ en la membrana plasmática, provocando la acidificación de la solución de la pared celular. La acidificación de la pared activa expansins, que son endógena de desprendimiento de la pared de las proteínas ^4, haciendo que la pared celular a ceder a las tensiones creadas por la presión de la pared celular de turgencia. Como resultado, la célula comienza a crecer rápidamente. Este fenómeno de crecimiento de ácido 'se mide fácilmente en el aislamiento (no vivos) muestras de la pared celular. La capacidad de las paredes de las células a sufrir inducida por el ácido de extensión no es simplemente el resultado de la disposición estructural de los polisacáridos de la pared celular (pectinas, por ejemplo), pero depende de la actividad de expansins ^5. Expansinas no tienen actividad enzimática conocida y la única manera de ensayo para la actividad expansina es medir su inducción de la extensión de la pared celular. Este informe de detalles del vídeo de las fuentes y técnicas de preparación para la obtención de materiales adecuados para los ensayos de la pared expansina y pasa a mostrar inducida por el ácido de extensión y expansina inducida por la extensión de las muestras de la pared preparada a partir de hipocotilos de pepino en crecimiento.

Para obtener muestras adecuadas de la pared celular, las plántulas de pepino se cultiva en la oscuridad, los hipocotilos se cortan y se congelan a -80 ° C. Hipocotilos congelados son desgastado, aplastado, y sujeta a una tensión constante en una cubeta especial para la medición del extensómetro. Para medir la inducida por el ácido de extensión, las paredes están inicialmente tamponada a pH neutro, lo que resulta en una baja actividad de expansins que son componentes de las paredes celulares de origen. Tras el intercambio de buffer de pH ácido, expansins se activan y las paredes celulares se extienden rápidamente. También demuestran una actividad expansina en un ensayo de reconstitución. Para esta parte, se utiliza un tratamiento térmico breve para desnaturalizar el expansins nativos en las muestras de la pared celular. Estas paredes de las células inactivadas no se dan incluso en tampón ácido, pero la adición de expansins de las paredes celulares rápidamente recupera su capacidad de extender.

Protocol

Parte 1: Crecimiento y el almacenamiento de material vegetal adecuado

1. En nuestra experiencia, hipocotilos jóvenes de plántulas de pepino etioladas servir como una fuente conveniente de material de la pared celular de estos experimentos. Las semillas de pepino se siembran en papel mojado en una caja a prueba de luz, que es mantener en un armario oscuro en una sala a temperatura constante fijado en 26 ° C. La temperatura exacta no es crítica, ya que cualquier cosa entre 22 ° y 30 ° C debe estar bien, pero la temperatura va a determinar qué tan rápido las plántulas alcanzan una fase de desarrollo. Cuanto más caliente esté la temperatura, más rápido que las plántulas se desarrollan. Por lo general utilizan plantas cuando han crecido a cerca de 5 cm de longitud, que se alcanza de 3-4 días después de la siembra. Es importante que las plántulas se cultivan en la oscuridad, ya que incluso pequeñas cantidades de luz afectan tanto a la tasa de desarrollo de las plántulas y las propiedades de la pared celular que se mide con esta técnica. El día 3 se puede mirar en la caja, con una tenue luz verde filtrada, para comprobar el desarrollo de la plántula.
2. Las plántulas son rápidamente cortados y envasados ​​en pequeñas cajas de plástico, 100-150 plantas por caja, y se almacenan a -80 ° C. A esta temperatura siguen siendo útiles para la semana.

Parte 2: Preparación de muestras de la pared celular

1. Los grupos pequeños (8-10) de las plántulas de corte congelado se transfieren desde el congelador para un recipiente aislado que contiene un bloque de congelación -80.
2. La cutícula que cubre el hipocotilo se desgasta con el carburo de silicio. Esto se hace en varias ocasiones la elaboración del hipocotilo entre el pulgar y el índice, que están recubiertas con una mezcla espesa de polvo de carborundo húmedo. Se necesita un poco de experiencia para saber la cantidad correcta de presión para el uso: demasiada presión y la capa de la epidermis comienza a ser destrozado y roto, demasiado poco de presión y la cutícula no se permeabilized. Uno también tiene que trabajar con rapidez porque, como el deshielo de hipocotilo congelados, se vuelve flácida y difícil de manejar.
3. El hipocotilo desgastado se sumerge en agua helada para eliminar la mayoría de los carborundo adhiere y se almacena en el agua helada, mientras que el resto de hipocotilos se preparan de manera similar.
4. El hipocótilo se cortan a la longitud deseada, por lo general 1,2 cm, con una nueva hoja de afeitar solo filo y alineados en un portaobjetos de vidrio.
5. Ahora tenemos que aplanar las paredes para quitar la savia celular y para facilitar la sujeción. Una segunda lámina de vidrio se coloca en la parte superior del grupo de 8-10 muestras, formando un sandwich. Un peso (400-500 g) se coloca en la parte superior de la lámina de vidrio de 5 min. Por el peso que utilizan de forma habitual un vaso que contiene una cantidad adecuada de agua.
6. Paso opcional: Dependiendo del experimento, los hipocotilos puede ser inactivado con un tratamiento térmico breve en este punto. Para ello se unen las placas de vidrio junto con un par de bandas de goma, colocar el ensamblado en un recipiente con 100 ml de agua desionizada a temperatura ambiente y colóquelo en el microondas a máxima potencia. Con nuestro horno microondas el agua comienza a hervir a unos 50 s, y dejamos el microondas 15 s después de la ebullición comienza. El agua caliente se vierte rápidamente y se reemplaza con agua fría para detener la desnaturalización. Puede que tenga que modificar estos tiempos, como el horno de microondas puede ser diferente a la nuestra. Con un calentamiento excesivo de las muestras se debilitan y se rompen con facilidad. Con un calentamiento insuficiente la expansina endógeno no se inactiva y las muestras de la pared conservan la capacidad de respuesta a pH ácido.

Parte 3: Configuración de extensómetro

1. Las muestras de la pared están fijadas en un extensómetro fuerza constante. Se trata de un dispositivo de costumbre-construido que consta de una cubeta de Plexiglas para la celebración de la final de la muestra basal de la pared y una pinza móvil conectado al extremo apical de la muestra. La pinza móvil se monta en el extremo de una varilla que pasa a través de las bobinas abiertas de un sensor de posición, un LVDT o "lineal transformador diferencial variable", que detecta electrónicamente la posición de un pequeño cilindro metálico, o "núcleo", es decir, unido a la barra. El extremo superior de la varilla está vinculado a una palanca con un contrapeso ajustable. Esta palanca ejerce una cantidad ajustable de la fuerza hacia arriba sobre la muestra de la pared. La fuerza se ajusta mediante la adición o eliminación de calibrar pesas de metal hacia el otro extremo de la palanca.
2. Volver a la muestra de la pared - el extremo de la base de la muestra hipocotilo es recogido con unas pinzas finas y ~ 2.3 mm del extremo apical se sitúa entre las fauces abiertas de la mordaza móvil. Esta pinza es una pinza de cocodrilo con resorte de metal, cuya boca se cubren con plástico para evitar el contacto directo entre la superficie del metal y la solución tampón o la muestra de la pared. En nuestra experiencia de los iones metálicos pueden filtrarse de la pinza e inhiben la capacidad de la pared de extender, por lo que mantener los cubiertos de metal.
3. La celebración de la abrazadera móvil en una mano, el extremo de la base de la muestra de la pared es ahora maniobrar entre las dos piezas con bisagras de la cubeta de Plexiglas y la cubetapiezas se unen y se atornilla apretado, con lo que el bloqueo del extremo inferior de la muestra de la pared de la cubeta.
4. La mordaza móvil es ahora ligeramente en libertad, lo que permite la plena vigencia de los contrapesos que se transfiere a la muestra de la pared. Nosotros usamos un contrapeso total de 20 g para las muestras de la pared preparada a partir de hipocotilos de pepino. Otros materiales de la pared o los experimentos podrían requerir diferentes pesos.
5. La cubeta se llena con tampón (200 uL) y la posición de la cubeta hacia arriba o hacia abajo con un tornillo de ajuste, de modo que la pinza móvil es llevado al extremo inferior del rango de medición de LVDT. Nuestra LVDT está conectado a una unidad de adquisición de datos de una microcomputadora, por lo que controlar la posición LVDT a través del ordenador. Tenemos ocho asambleas LVDT conectado en paralelo con un ordenador, lo que nos permite ejecutar 8 muestras de la pared al mismo tiempo. La computadora registra la posición de cada uno de los conjuntos de LVDT una vez cada 30 s.

Parte 4: Medición de la respuesta de extensión a pH ácido o expansina - Resultados de la Representante

1. [Primer experimento] Para la medición de ácido inducida por extensión, comenzamos con las muestras de la pared nativos (es decir, no se inactivan con el calor) y tampón neutral se añade a la cubeta. Las muestras de la pared se extienden por unos minutos, en respuesta a la tensión añadida, pero la extensión decae a una tasa baja después de unos minutos. Nuestro equipo nos permite monitorear el cambio en la longitud de la muestra (es decir, el cambio en la posición de la pinza móvil, después del inicio del experimento) o se puede controlar la derivada de la posición, es decir, la tasa de extensión . La tasa de extensión se estabiliza en un valor bajo, con el tiempo.
2. Después de aproximadamente 20 minutos, el amortiguador neutral se elimina. Nosotros usamos un tubo de metal fino, hecho de una aguja hipodérmica de calibre grande, conectado a una bomba de vacío para eliminar el buffer rápidamente, con una perturbación mínima de la pared o el montaje mecánico. Tampón ácido se añade, a veces con 1-2 intercambios rápidos para asegurar el intercambio completo de tampón ácido. Entonces sentarse y ver la respuesta de la pared. Por lo general se puede detectar la velocidad más rápida de la extensión en pocos minutos. Después de 60 minutos por lo general tienen suficiente información para evaluar la respuesta de extensión, aunque en algunos casos, las medidas pueden extenderse a periodos más largos.
3. [Segundo experimento] Para la medición de expansina inducida por la extensión de la pared celular, se comienza con las muestras de la pared inactivado por calor y tampón ácido se añade a la cubeta. Al igual que en el primer experimento, la tasa de extensión de la pared celular poco a poco se estabiliza en un valor bajo debido a la falta de expansina funcional.
4. Después de aproximadamente 20 min, las proteínas expansina se añade a la cubeta de 'picos' de la memoria intermedia en la cubeta con 10-20 l de una solución expansina. El expansina penetra rápidamente en la muestra de la pared celular y en pocos minutos, vemos que la tasa de extensión se ha incrementado. Esta respuesta de la extensión puede ser seguido por una hora o más.

Figura 1: Esquema de los procedimientos para la preparación de las paredes celulares para evaluar inducida por el ácido o expansina inducida por la extensión de la pared.

Discussion

Para esta demostración se utilizó las paredes celulares de hipocotilos de pepino, ya que han demostrado ser una fuente confiable de las muestras de la pared que son fáciles de manejar y que responden con buena sensibilidad. También hemos tenido mucho éxito con las paredes de las plántulas, así como otros materiales de algunos de los supermercados, tales como hojas de espinacas jóvenes y tallos de apio. Básicamente, el joven, suave y rápido crecimiento de los tejidos vegetales es probable que sean fáciles de medir con esta técnica, pero duro, viejo, oxidado o estacionaria tejidos de la planta es poco probable que responda a causa de la pared celular de la reticulación. Hay algunas otras cosas que tengan cuidado con:

1. Variabilidad biológica - incluso plántulas uniformes dar respuestas variables, por lo que se replica con un mínimo de 8.5 es necesario para obtener resultados estadísticamente significativos.
2. Abrasión de la cutícula es importante para permitir una rápida penetración de buffers y las proteínas en la muestra de la pared celular. Si la cutícula no es lo suficientemente desgastado, las respuestas a las reservas de ácido será lento y apagado y las proteínas no pueden incluso penetrar en la cutícula para obtener una respuesta. Algunos ejemplos podrían no necesitar la abrasión, es decir, si utiliza las cáscaras epidérmico y otros tejidos disecados. Abrasión no uniforme añade una variabilidad significativa para muchos principiantes.
3. La inactivación por calor, que se utiliza para eliminar o desnaturalizar expansins endógena, puede ser llevada a cabo por otros métodos, pero uno tiene que encontrar la cantidad mínima de calentamiento para inactivar expansina endógenos para evitar el debilitamiento excesivo y la rotura de las muestras de la pared.
4. Expansinas son propensas a la inactivación por oxidación, por lo que 1.5 mM ditiotreitol en la memoria por lo general ayuda a estabilizar la actividad.
5. El extensómetro no es un off-the-shelf pieza de equipo, sino que requiere de la construcción a medida de (a) de la cubeta que contiene la muestra de la pared y (b) la reunión LVDT-clamp-contrapeso. La interfaz de la computadora y la unidad de adquisición de datos no son esenciales, pero son particularmente valiosos para el funcionamiento de muestras repetidas de forma simultánea y para el análisis de las curvas de extensión cuantitativa.