Summary
हम एक निरंतर बल एक्सटेन्सोमीटर का उपयोग करने के लिए संयंत्र सेल की दीवार नमूनों की लंबी अवधि के विस्तार (रेंगना) अम्लीय buffers और expansin प्रोटीन से प्रेरित उपाय प्रदर्शित करता है.
Protocol
भाग 1: बढ़ते और उपयुक्त संयंत्र सामग्री भंडारण
- हमारे अनुभव में, etiolated ककड़ी seedlings से युवा hypocotyls कोशिका दीवार सामग्री के इन प्रयोगों के लिए एक सुविधाजनक स्रोत के रूप में सेवा करते हैं. ककड़ी के बीज गीला कागज पर प्रकाश सबूत, एक बॉक्स ° जो एक अंधेरे कैबिनेट में एक निरंतर तापमान 26 पर सेट कमरे में रखना है सी. में बोया जाता है सही तापमान महत्वपूर्ण नहीं है, सी 22 ° और 30 ° के बीच में कुछ के रूप में ठीक किया जाना चाहिए, लेकिन तापमान को निर्धारित कितनी तेजी से seedlings के विकास के एक उचित मंच तक पहुँचने. गर्म तापमान, तेजी से seedlings का विकास होगा. हम आम तौर पर seedlings का उपयोग करें जब वे के बारे में लंबाई में 5 सेमी, जो बुवाई के बाद 3-4 दिनों तक पहुँच जाता है के लिए हो गए हैं. यह महत्वपूर्ण है कि अंकुर अंधेरे में उगाया जा के रूप में प्रकाश की भी थोड़ी मात्रा अंकुर विकास के दोनों दर और कोशिका दीवार गुण है कि हम इस तकनीक के साथ उपाय को प्रभावित. 3 दिन आप बॉक्स में झांकना, एक धुंधला हरे प्रकाश फ़िल्टर का उपयोग कर सकते हैं, अंकुर विकास पर जाँच.
- Seedlings तेजी से काट रहे हैं और छोटे प्लास्टिक के बक्से, बॉक्स प्रति 100-150 seedlings में पैक, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत इस तापमान में वे सप्ताह के लिए उपयोगी रहेगा.
भाग 2: सेल की दीवार के नमूने की तैयारी
- फ्रीजर से जमे हुए कटौती seedlings के छोटे समूहों (8-10) एक अछूता कंटेनर युक्त -80 फ्रीजर ब्लॉक करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं.
- hypocotyl कवर छल्ली कारबरंडम के साथ abraded है. इस बार बार - अंगूठे और तर्जनी, जो गीला कारबरंडम पाउडर की एक मोटी घोल के साथ लेपित हैं के बीच hypocotyl ड्राइंग द्वारा किया जाता है. यह एक छोटे से अनुभव लेता करने के लिए उपयोग करने के लिए दबाव की सही मात्रा में पता है: बहुत अधिक दबाव और epidermal परत के लिए कटा हुआ है और फटे शुरू होता है, बहुत कम दबाव और छल्ली permeabilized नहीं किया जाएगा. एक भी जल्दी से काम क्योंकि जमी hypocotyl thaws के रूप में, यह झूलता हुआ और प्रबंधन के लिए मुश्किल हो जाता है.
- abraded hypocotyl बर्फ के पानी में डूबा हुआ है जबकि शेष hypocotyls एक समान तरीके में तैयार कर रहे हैं पालन कारबरंडम और फिर बर्फ के पानी पर संग्रहीत की सबसे हटा.
- hypocotyls इच्छित लंबाई, आम तौर पर 1.2 सेमी करने के लिए काट रहे हैं, एक नए एकल धार धार के साथ और फिर एक गिलास स्लाइड पर संरेखित.
- अब हम दीवारों को समतल सेल सार हटाने और clamping को सुविधाजनक बनाने की जरूरत है. एक दूसरा गिलास स्लाइड 8-10 नमूने के समूह के शीर्ष पर रखा है, एक सैंडविच बनाने. एक वजन (400-500 छ) 5 मिनट के लिए गिलास स्लाइड के शीर्ष पर रखा गया है. वजन के लिए हम नियमित रूप से पानी की एक उपयुक्त राशि युक्त बीकर का उपयोग करें.
- वैकल्पिक कदम: प्रयोग पर निर्भर करता है, hypocotyls इस बिंदु पर एक संक्षिप्त गर्मी उपचार के साथ निष्क्रिय हो सकता है. हम ऐसा करने के बाँध कांच रबर बैंड की एक जोड़ी के साथ एक साथ स्लाइड, de-ionized पानी के 100 एमएल के साथ एक कंटेनर में कमरे के तापमान पर विधानसभा डाल और इसे पूर्ण सत्ता में एक माइक्रोवेव ओवन में जगह है. हमारे माइक्रोवेव ओवन के साथ पानी के बारे में 50 एस पर फोड़ा करने के लिए शुरू होता है और हम माइक्रोवेव के बाद 15 एस रोक उबलते शुरू होता है. गर्म पानी जल्दी से डाल दिया है और ठंडे पानी के साथ प्रतिस्थापित विकृतीकरण रोक. आप इन समय भिन्न है, के रूप में अपने माइक्रोवेव हमारा से अलग हो सकता है हो सकता है. अत्यधिक हीटिंग के साथ नमूने कमजोर हो जाते हैं और आसानी से तोड़. अपर्याप्त हीटिंग के साथ अंतर्जात expansin निष्क्रिय और नहीं दीवार नमूनों अम्लीय pH करने के लिए कुछ जवाबदेही को बनाए रखने.
भाग 3: एक्सटेन्सोमीटर सेटअप
- दीवार नमूनों अब एक निरंतर बल एक्सटेन्सोमीटर में clamped हैं. यह कस्टम निर्मित एक युक्ति है कि दीवार नमूना और एक जंगम नमूने के शिखर के अंत से जुड़ी दबाना बेसल छोर पकड़े के लिए एक Plexiglas क्युवेट के होते है. LVDT या 'रैखिक चर विभेदकों ट्रांसफार्मर, कि इलेक्ट्रॉनिक एक छोटे से धातु सिलेंडर की स्थिति का पता लगाता है या' कोर 'जंगम दबाना है कि एक स्थिति सेंसर के खुले coils के माध्यम से गुजरता एक छड़ी के अंत पर मुहिम शुरू की है, वह यह है कि छड़ी करने के लिए संलग्न. छड़ी के ऊपरी अंत के साथ एक समायोज्य तोड़ एक लीवर से जुड़ा हुआ है. यह लीवर ऊपर बल की दीवार नमूना पर एक समायोज्य राशि डाल रही है. बल जोड़ने या लीवर के अंत तक के लिए calibrated धातु वजन को हटाने के द्वारा निकाला जाता है.
- वापस दीवार नमूना - hypocotyl नमूने के बेसल अंत ठीक संदंश और ~ शिखर के अंत के 2-3 मिमी जंगम क्लैंप के खुले जबड़े के बीच में रखा जाता है के साथ उठाया है. यह दबाना एक मगरमच्छ वसंत लोड दबाना धातु जिसका जबड़े प्लास्टिक के साथ लेपित हैं धातु की सतह और समाधान बफर या दीवार नमूना के बीच सीधे संपर्क को रोकने है. हमारे अनुभव धातु आयनों में दीवार का विस्तार करने के लिए, और इसलिए हम रखने के लिए धातु कवर करने की क्षमता को बाधित क्लैंप से नमकीन पानी कर सकते हैं और.
- एक हाथ में जंगम दबाना विधानसभा होल्डिंग, अब दीवार नमूना के बेसल अंत Plexiglas क्युवेट और क्युवेट के दो hinged टुकड़ों के बीच में चतुराईटुकड़े को एक साथ लाया जाता है और तंग खराब कर दिया है, जिससे क्युवेट में दीवार नमूना के नीचे अंत ताला लगा.
- जंगम दबाना विधानसभा अब धीरे जारी है, अनुमति counterweights की पूरी शक्ति दीवार नमूना करने के लिए स्थानांतरित. हम नियमित रूप से दीवार ककड़ी hypocotyls से तैयार नमूनों के लिए 20 ग्राम के एक कुल तोड़ का उपयोग करें. अन्य दीवार सामग्री या प्रयोगों अलग अलग वजन की आवश्यकता हो सकती है.
- क्युवेट बफर के साथ भरा है (200 उल) और क्युवेट की स्थिति या स्थानांतरित नीचे एक समायोजन पेंच के साथ, ताकि जंगम दबाना LVDT मापने रेंज के निचले अंत करने के लिए लाया जाता है. हमारे LVDT एक माइक्रो कंप्यूटर के डाटा अधिग्रहण इकाई से जुड़ा है, और इसलिए हम कंप्यूटर के माध्यम से LVDT स्थिति की निगरानी. हम आठ LVDT विधानसभाओं है एक कंप्यूटर है, जो हमें 8 दीवार नमूने को चलाने के लिए एक साथ की अनुमति देता है के साथ समानांतर में जुड़े. कंप्यूटर हर एस एक बार 30 LVDT विधानसभाओं में से प्रत्येक की स्थिति रिकॉर्ड
भाग 4: माप विस्तार एसिड पीएच या expansin के जवाब - प्रतिनिधि परिणाम
- एसिड प्रेरित विस्तार के माप के लिए [पहला प्रयोग], हम देशी दीवार (है कि, गर्मी के साथ निष्क्रिय नहीं है) नमूने और तटस्थ बफर के साथ शुरू क्युवेट करने के लिए जोड़ा है. कुछ मिनट के लिए दीवार नमूनों का विस्तार, जोड़ा तनाव के जवाब में है, लेकिन विस्तार decays कुछ ही मिनटों के बाद एक कम दर के लिए. हमारे कंप्यूटर की मदद से हमें या तो नमूना की लंबाई में परिवर्तन (है कि, जंगम क्लैंप की स्थिति में बदलाव के प्रयोग की शुरुआत के बाद) की निगरानी या हम स्थिति के समय व्युत्पन्न की निगरानी कर सकते हैं दूसरे शब्दों में विस्तार की दर . विस्तार दर समय के साथ एक कम मूल्य स्थिर है.
- ~ 20 मिनट के बाद, तटस्थ बफर हटा दिया जाता है. हम एक पतली धातु पाइप, एक बड़े गेज चमड़े के नीचे सुई से बने, एक वैक्यूम पंप से जुड़े बफर जल्दी से दीवार के न्यूनतम अशांति या यांत्रिक विधानसभा के साथ, हटाने का उपयोग करें. अम्लीय बफर तो है, कभी कभी 1-2 त्वरित आदान - प्रदान के साथ अम्लीय बफर पूरा विनिमय बीमा जोड़ा. फिर हम वापस बैठते हैं और दीवार की प्रतिक्रिया घड़ी है. आमतौर पर हम कुछ ही मिनटों में विस्तार की तेज दर का पता लगा सकते हैं. 60 मिनट के बाद हम आम तौर पर विस्तार जवाब का आकलन करने के लिए पर्याप्त जानकारी है, हालांकि कुछ मामलों में माप लंबी अवधि का विस्तार कर सकते हैं.
- [दूसरा प्रयोग] expansin प्रेरित कोशिका दीवार एक्सटेंशन की माप के लिए, हम गर्मी निष्क्रिय दीवार नमूनों और अम्लीय बफर के साथ शुरू क्युवेट करने के लिए जोड़ा है. पहला प्रयोग के रूप में, कोशिका दीवार एक्सटेंशन की दर धीरे - धीरे कार्यात्मक expansin की कमी की वजह से एक कम मूल्य स्थिर है.
- ~ 20 मिनट के बाद, expansin प्रोटीन क्युवेट में बफर के साथ एक expansin समाधान के 10-20 उल के साथ 'spiking' द्वारा क्युवेट करने के लिए जोड़ा जाता है. expansin तेजी कोशिका दीवार नमूना प्रवेश और कुछ ही मिनटों के भीतर हम देखते हैं कि विस्तार की दर बढ़ गया है. इस विस्तार प्रतिक्रिया एक घंटे या अधिक के लिए पीछा किया जा सकता है.
चित्रा 1: सेल दीवारों की तैयारी के लिए एसिड प्रेरित या expansin प्रेरित दीवार विस्तार का आकलन करने के लिए प्रक्रियाओं की बाह्यरेखा.
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Discussion
इस प्रदर्शन के लिए हम ककड़ी hypocotyls से सेल दीवारों का उपयोग किया है क्योंकि वे दीवार के नमूने है कि संभाल करने के लिए और है कि अच्छी संवेदनशीलता के साथ जवाब के लिए आसान कर रहे हैं एक विश्वसनीय स्रोत हो साबित कर दिया है. हम भी अन्य रूप में अच्छी तरह के रूप में सुपरमार्केट से कुछ सामग्री जैसे युवा पालक के पत्तों और अजवाइन डंठल, seedlings से दीवारों के साथ अच्छी सफलता मिली है. असल में, युवा, मुलायम, तेजी से बढ़ती संयंत्र के ऊतकों को आसानी से इस तकनीक के साथ मापा होने की संभावना हैं, लेकिन कठिन, बूढ़े, ऑक्सीकरण या nongrowing संयंत्र के ऊतकों दीवार पार जोड़ने सेल की वजह से संवेदनशील होने की संभावना नहीं हैं. वहाँ कुछ अन्य बातें कर रहे हैं से सावधान रहना:
- जैविक परिवर्तनशीलता भी वर्दी seedlings चर प्रतिक्रिया देते हैं, तो 5-8 की एक न्यूनतम प्रतिकृति सांख्यिकीय सार्थक परिणाम के लिए आवश्यक है.
- छल्ली के घर्षण महत्वपूर्ण है और buffers कोशिका दीवार नमूना में प्रोटीन की तेजी से पैठ की अनुमति है. यदि छल्ली पर्याप्त नहीं abraded है, अम्लीय बफ़र्स के लिए प्रतिक्रियाओं धीमी और मौन हो सकता है और प्रोटीन भी छल्ली नहीं घुसना करने के लिए एक प्रतिक्रिया बटोर सकता है. कुछ नमूने घर्षण, यानी, की जरूरत नहीं है यदि आप epidermal peels या अन्य dissected ऊतकों का उपयोग हो सकता है. Nonuniform घर्षण कई novices के लिए महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता कहते हैं.
- हीट निष्क्रियता है जो उसे हटाने या अंतर्जात expansins denature करने के लिए प्रयोग किया जाता है, अन्य तरीकों से बाहर ले सकते हैं, लेकिन एक की जरूरत है अंतर्जात expansin और दीवार नमूनों की अत्यधिक कमजोर टूटना से बचने के निष्क्रिय हीटिंग की न्यूनतम राशि को खोजने के लिए.
- Expansins ऑक्सीकरण द्वारा निष्क्रियता के लिए प्रवण रहे हैं, तो 1-5 मिमी बफर में dithiothreitol आमतौर गतिविधि को स्थिर करने में मदद करता है.
- एक्सटेन्सोमीटर उपकरणों की एक बंद शेल्फ टुकड़ा नहीं है, लेकिन (क) क्युवेट है कि दीवार नमूना और (ख) विधानसभा LVDT दबाना - तोड़ रखती के कस्टम निर्माण की आवश्यकता है. कंप्यूटर इंटरफेस और डाटा अधिग्रहण इकाई के लिए आवश्यक नहीं हैं, लेकिन को दोहराने के नमूने को एक साथ चलाने के लिए और विस्तार घटता मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विशेष रूप से मूल्यवान हैं.
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Acknowledgments
यहाँ दिखाया तकनीकों धन के साथ ऊर्जा विभाग (Bioenergy विज्ञान) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा विकसित किए गए.
References
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