Mätning Plant Cell Wall Extension (Creep) induceras av surt pH-värde och Alpha-Expansin

Summary

Vi visar användandet av en konstant kraft tensiometer att mäta långsiktiga förlängning (krypning) av vägg växtcell exemplar induceras av sura buffertar och expansin protein.

Abstract

Växande plantan cellväggar uppvisar karakteristiskt en fastighet som kallas "sura tillväxt", med vilket vi menar de är mer utbyggbar vid lågt pH (<5) ^1. Anläggningen hormonet auxin stimulerar snabbt cell förlängningen i unga stjälkar och liknande vävnader åtminstone delvis av en syra-tillväxt mekanism ^{2, 3.} Auxin aktiverar en H ⁺ pump i plasmamembranet, vilket leder till försurning av cellväggen lösningen. Wall försurning aktiverar expansins, som är endogena cellväggen-lossa proteiner ^4, vilket gör cellväggen att ge på väggen spänningar som skapas av cellen saftspänningen. Som ett resultat börjar cellen att förstora snabbt. Denna "sura tillväxt" Fenomenet är lätt mäts i isolerade (icke-levande) exemplar cellvägg. Förmåga cellväggar att genomgå sura-inducerad förlängning är inte bara ett resultat av den strukturella placeringen av polysackarider cellväggen (t.ex. pektiner), men beror på den aktivitet expansins ^5. Expansins inte har någon känd enzymatisk aktivitet och det enda sättet att assay för expansin verksamhet är att mäta deras induktion av cellvägg förlängning. Denna video rapport redovisar källor och tekniker förberedelse för att få ett passande väggmaterial för expansin analyser och fortsätter att visa sura-inducerad förlängning och expansin-inducerad förlängning av vägg prov som har beretts från att växa gurka hypocotyls.

För att få lämpliga prover cellväggen, gurka plantor odlas i mörker, är hypocotyls klippa och frysas vid -80 ° C. Frysta hypocotyls är skadad, stryks ut, och sedan spänns fast med konstant spänning i en speciell kyvett för tensiometer mätningar. För att mäta syra-inducerad förlängning, är väggarna initialt buffrade vid neutralt pH, vilket resulterar i låga aktivitet expansins som är delar av den infödda cellväggar. När bufferten utbyte till surt pH-värde, är expansins aktiveras och cellväggarna förlänga snabbt. Vi visar också expansin verksamhet i en beredning analys. För denna del använder vi en kort värmebehandling för att denaturera infödda expansins i cellväggen prover. Dessa inaktiverat cellväggar sträcker sig inte ens i sura buffert, men tillägg av expansins att cellväggarna snabbt återställer deras förmåga att förlänga.

Protocol

Del 1: Odling och lagring lämpligt växtmaterial

1. Vår erfarenhet är att unga hypocotyls från etiolated gurka plantor tjäna som en bekväm källa cellvägg material för dessa experiment. Gurka frön sås på vått papper i en ljus-låda, som håller i ett mörkt skåp i en konstant temperatur rum inställd på 26 ° C. Den exakta temperaturen är inte kritisk, eftersom allt mellan 22 ° och 30 ° C ska vara bra, men temperaturen kommer att avgöra hur snabbt plantorna nå en lämplig utvecklingsstadium. Ju varmare temperatur, desto snabbare plantorna kommer att utvecklas. Vi använder vanligtvis plantorna när de har vuxit till ca 5 cm långa, vilket uppnås 3-4 dagar efter sådd. Det är viktigt att plantan odlas i mörker, eftersom även små mängder av ljus påverkar både graden av plantan utveckling och cellegenskaper vägg som vi mäter med denna teknik. På dag 3 kan du kika i lådan, med en svagt grön filtrerat ljus, för att kontrollera fröplanta utveckling.
2. Plantor snabbt klippa och förpackas i små plastlådor, 100-150 plantor per låda, och förvaras vid -80 ° C. Vid denna temperatur de förblir användbara för veckor.

Del 2: Förbereda cellväggen prover

1. Små grupper (8-10) av frysta snitt plantor överförs från frysen till en isolerad behållare som innehåller en -80 frys block.
2. Nagelbanden täcker hypokotyl är slipade med carborundum. Detta görs genom att upprepade gånger dra hypokotyl mellan tummen och pekfingret, som är belagda med en tjock slurry av våt carborundum pulver. Det tar lite erfarenhet för att veta rätt mängd tryck att använda: för mycket tryck och den epidermala lagret börjar bli strimlas och rivas, för lite tryck och nagelband kommer inte att permeabilized. Man måste också arbeta snabbt eftersom den frysta hypokotyl tinar blir det slapp och svårt att hantera.
3. Det slipas hypokotyl är doppad i isvatten för att ta bort det mesta av det fastsittande karborundum och sedan lagras på isvatten medan resterande hypocotyls är beredda på ett liknande sätt.
4. Den hypocotyls kapas till önskad längd, vanligtvis 1,2 cm, med en ny singel kanter rakblad och sedan anpassas till en glasskiva.
5. Nu måste vi platta på väggarna för att ta bort cellen SAP och för att underlätta fastspänning. En andra glasskiva placeras på toppen av gruppen 8-10 prover, bildar en smörgås. En vikt (400-500 g) är placerad på toppen av glaset bilden i 5 minuter. För den vikt vi använder rutinmässigt en bägare som innehåller en lämplig mängd vatten.
6. Valfritt steg: Beroende på försöket kan hypocotyls att inaktiveras med en kort värmebehandling vid denna punkt. För detta behöver vi binder glasskivor tillsammans med ett par gummiband lade montering i en behållare med 100 ml avjoniserat vatten vid rumstemperatur och placera den i en mikrovågsugn på full effekt. Med vår mikrovågsugn vattnet börjar koka i ca 50 s och vi stannar mikron 15 sekunder efter kokning börjar. Det varma vattnet snabbt hälls bort och ersättas med kallt vatten för att stoppa denaturering. Du måste kanske variera dessa tidpunkter, som din mikrovågsugn kan vara annorlunda än vår. Med hög värme proverna blir svaga och går lätt sönder. Med otillräcklig uppvärmning av endogena expansin inte är inaktiverat och väggen prover behålla en del lyhördhet för surt pH.

Del 3: tensiometer inställning

1. Väggen proverna är nu spänns fast i en konstant kraft tensiometer. Detta är en specialbyggd enhet som består av ett plexiglas kyvett för att hålla de basala slutet av väggen prov och en rörlig klämma fäst den apikala änden av provet. Den rörliga klämman är monterad i änden av en stång som går genom de öppna spolar av en position sensor, en LVDT eller "Linear Variable Differential Transformer", som elektroniskt identifierar positionen av en liten metallcylinder, eller "kärna", det vill säga fäst vid stången. Den övre änden av staven är kopplad till en spak med en justerbar motvikt. Denna spak utövar en justerbar mängd uppåtriktad kraft på väggen prov. Kraften justeras genom att lägga till eller ta bort kalibrerade metall vikter för att den bortre änden av spaken.
2. Tillbaka till väggen prov - är den basala slutet av hypokotyl provet plockas upp med fin pincett och ~ 2-3 mm av den apikala änden placeras i mellan det öppna käftar den rörliga klämman. Detta klämman är en fjäderbelastad alligator klämma vars metall käftar är täckta med plast för att förhindra direkt kontakt mellan metallytan och den buffertlösning eller väggen provet. I vår joner erfarenhet metall kan läcka från klämman och hämmar väggen förmåga att förlänga, så vi håller metall omfattas.
3. Håll rörliga klämman församlingen i ena handen, är den basala slutet av väggen provet nu manövreras mellan de två gångjärnsförsedda bitar av plexiglas kyvetten och kyvettendelar förs samman och skruvas fast, och därmed låsa den nedre delen av väggen i kyvetten.
4. Den rörliga klämman monteringen är nu försiktigt ut, vilket gör att full kraft av motvikter som ska överföras till väggen provet. Vi använder rutinmässigt en total motvikt på 20 g för vägg-prov som har beretts av gurka hypocotyls. Andra väggmaterial eller experiment kan kräva olika vikter.
5. Kyvetten är fylld med buffert (200 UL) och placeringen av kyvetten flyttas uppåt eller nedåt med en justering skruv, så att den rörliga klämman förs till den lägre änden av LVDT mätområdet. Vår LVDT är ansluten till en datainsamling enhet av en mikrodator, och vi övervakar LVDT ställning genom datorn. Vi har åtta LVDT församlingar kopplade parallellt med en dator, vilket gör att vi kan köra 8 väggen prover samtidigt. Datorn registrerar positionen för varje LVDT församlingarna var 30 s.

Del 4: Mätning förlängning svar på surt pH eller expansin - representativa resultat

1. [Första experiment] För mätning av syra-inducerade förlängningen, vi börjar med infödda vägg prover (det vill säga inte inaktiveras med värme) och neutral buffert läggs till i kyvetten. Väggen prover förlänga ett par minuter, som svar på den ökade spänningen, men förlängningen sönderfaller till en låg efter några minuter. Vår dator låter oss följa förändringen i längden av provet (det vill säga förändringen i position rörliga klämman, efter starten av försöket) eller vi kan övervaka tiden derivatan av läget, med andra ord takten i förlängningen . Förlängningen hastighet stabiliseras till ett lågt värde med tiden.
2. Efter ~ 20 min, är neutral buffert bort. Vi använder ett tunt metallrör, tillverkad av ett stort gauge injektionsnål, ansluten till en vakuumpump för att ta bort bufferten snabbt, med minimal störning av väggen eller mekanisk montering. Sura buffert läggs därefter, ibland med 1-2 snabba utbyten att försäkra fullständigt utbyte för att sura buffert. Då kan vi luta oss tillbaka och titta på svaret från väggen. Normalt kan vi upptäcka snabbare till förlängning i ett par minuter. Efter 60 minuter har vi oftast tillräckligt med information för att bedöma förlängningen svar, men i vissa fall mätningar kan utsträckas till längre perioder.
3. [Andra Experiment] För mätning av expansin-inducerad cellväggen förlängning, vi börjar med värmeinaktiveras vägg prover och sura buffert läggs till i kyvetten. Liksom i det första experimentet, stabiliserar graden av cellväggen förlängning gradvis till ett lågt värde på grund av bristen på funktionella expansin.
4. Efter ~ 20 min, är expansin protein läggs till kyvetten med "spetsa" med bufferten i kyvetten med 10-20 ul en expansin lösning. Den expansin tränger snabbt provet cellväggen och inom några minuter ser vi att en utvidgning har ökat. Denna förlängning svar kan följas i en timme eller mer.

Figur 1: Sammanfattning av förfaranden för att förbereda cellväggar att bedöma syra-inducerad eller expansin-inducerad vägg förlängning.

Discussion

För denna demonstration använde vi cellväggar från gurka hypocotyls eftersom de har visat sig vara en pålitlig källa för vägg prover som är lätta att hantera och som svarar med god känslighet. Vi har också haft god framgång med väggar från andra plantor samt en del material från stormarknaden, till exempel unga spenat blad och stjälkar selleri. I grund och botten, ung, mjukt, snabbt växande växt vävnader är troligt att de lätt mätas med denna teknik, men tuffa, äldre, oxiderade eller nongrowing plantvävnader kommer sannolikt inte att vara lyhörd på grund av cellvägg kors länkning. Det finns några andra saker att se upp för:

1. Biologisk variation - även enhetliga plantor ger varierande svar, så minst 5-8 replikat är nödvändigt för att ge statistiskt signifikanta resultat.
2. Nötning av nagelband är viktigt att möjliggöra en snabb penetration av buffertar och proteiner i cellväggen provet. Om nagelbanden inte är tillräckligt skadad, kommer svar på sura buffertar vara långsam och dämpad och proteiner kan inte ens tränga in i nagelband att framkalla en reaktion. Vissa prover kanske inte behöver nötning, dvs om du använder epidermal peeling eller andra dissekeras vävnader. Nonuniform nötning lägger stor variation för många nybörjare.
3. Värmeinaktivering, som används för att ta bort eller urvattnat endogena expansins kan utföras av andra metoder, men man måste hitta den minimalt med värme för att inaktivera endogena expansin att undvika överdriven försvagning och brott i väggen prover.
4. Expansins är benägna att inaktivering genom oxidering, hjälper så 1-5 mm ditiotreitol i bufferten oftast för att stabilisera verksamheten.
5. Det tensiometer är inte en off-the-shelf utrustning, men kräver anpassad konstruktion av (a) kyvetten som håller väggen prov och (b) LVDT-clamp-motvikt montering. Datorn gränssnitt och datainsamling enhet är inte nödvändiga, men är särskilt värdefulla för att köra Identiska prover samtidigt och för att analysera förlängningen kurvorna kvantitativt.