Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (parte II: la purificazione e la cultura di isole umane) utilizzando un metodo modificato automatizzato.
Gestione del diabete di tipo 1 è onerosa, sia per l'individuo e la società, che costano oltre 100 miliardi di dollari all'anno. Nonostante l'uso diffuso di monitoraggio della glicemia e insulina formulazioni nuove, molte persone ancora sviluppare devastanti complicanze secondarie. Trapianto di isole pancreatiche in grado di ripristinare nei pressi di controllo normale del glucosio in pazienti diabetici<sup> 1</sup>, Senza il rischio di gravi episodi di ipoglicemia che sono associati con la terapia insulinica intensiva. Fornire sufficiente massa isolotto è importante per il trapianto di isole pancreatiche di successo. Tuttavia, le caratteristiche del donatore, reperimento di organi e la conservazione influenzare l'esito isolamento<sup> 2</sup>. Presso l'Università dell'Illinois a Chicago (UIC), abbiamo sviluppato un protocollo di successo isolamento con pendenza purificazione migliorato<sup> 3</sup>. Il programma è iniziato nel gennaio 2004 e più di 300 isolamenti sono stati effettuati fino a novembre 2008. Il pancreas sono stati inviati nelle soluzioni di conservazione a freddo (UW, University of Wisconsin o HTK, Istidina, Triptofano chetoglutarato)<sup> 4-7</sup> Al Laboratorio cella d'isolamento a UIC per l'isolamento delle isole. Isole pancreatiche sono stati isolati con il metodo UIC, che è una versione modificata del metodo originariamente descritto da Ricordi<em> Et al</em><sup> 8</sup>. Come descritto nella Parte I: Digestione e raccolta di tessuto pancreatico, pancreas umano è stato tagliato, cannulata, perfusi e digerito. Dopo la raccolta e almeno 30 minuti di incubazione in soluzione UW, il tessuto è stato caricato nel separatore cellulare (COBE 2991, Cobe, Denver, CO) per la depurazione<sup> 3</sup>. A seguito di purificazione, resa isolotto (espressi come equivalenti isolotto, IEQ), il volume dei tessuti, e la purezza è stato determinato in base ai metodi standard<sup> 9</sup>. Isolette isolate sono state coltivate in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), integrati da 1,5% di albumina umana, 0,1% insulina-transferrina-selenio (ITS), 1 ml di Ciprofloxacina, 5 ml di HEPES 1M, e 14,5 ml di Bicarbonato di Sodio 7,5% nel T175 matracci a 37 ° C durante la notte prima cultura isolotti sono stati trapiantati o utilizzati per la ricerca.
Nonostante significativi progressi nelle tecniche di isolamento delle isole umana, resa isolotto rimangono estremamente variabile e imprevedibile. Purificazione del tessuto pancreatico digerito è fondamentale per recuperare una sufficiente massa isola dopo il successo digestione enzimatica per il trapianto. Il metodo di purificazione UIC è raccomandato farlo poiché un recupero superiore di isole umane ad alta purezza è stato dimostrato utilizzando questo metodo. Inoltre, fino a 50 ml di tessuto digerito possono esse…
Supportato da fondazione presso la University of Illinois a Chicago, nonché delle cellule insulari Resource Center NIH di sovvenzione (RFA-RR 05-003), la Fondazione Cristoforo, la Fondazione Efroymson, e la Fondazione Tellabs.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt | 83.1812.500 | |
University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech Inc | 99-785-CV | |
Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |