Mänskliga Pancreatic Islet Isolering: Del II: Rening och kultur för mänskliga Islets
Summary
Uppnå hög kvalitet och lämplig mängd mänskliga skär är en av de framstående förutsättningarna för en framgångsrik ö-transplantation. I denna video beskriver vi steg för steg förfarandena för mänskliga bukspottkörteln holme isolering (del II: rening och kultur för mänskliga öar) med hjälp av en modifierad automatiserad metod.
Abstract
Hantering av typ 1 diabetes är betungande, både för individen och samhället, kostar över 100 miljarder dollar årligen. Trots den utbredda användningen av glukos övervakning och nya formuleringar insulin, många individer utvecklar fortfarande förödande sekundära komplikationer. Pankreas ö-transplantation kan återställa nära normal blodsockerkontroll hos diabetespatienter<sup> 1</sup>, Utan risk för allvarliga hypoglykemiska episoder som är förknippade med intensiv insulinbehandling. Ger tillräcklig holme massan är viktig för en framgångsrik ö-transplantation. Men donator egenskaper, tillvaratagandet av organ och konservering påverkar isoleringen resultatet<sup> 2</sup>. Vid University of Illinois i Chicago (UIC) har vi utvecklat en framgångsrik isolering protokoll med en förbättrad rening gradient<sup> 3</sup>. Programmet startade i januari 2004 och mer än 300 isoleringar utfördes fram till november 2008. Den pancreata sändes i kallt konserveringslösningar (UW, University of Wisconsin-eller HTK, histidin-Tryptofan ketoglutarat)<sup> 4-7</sup> Till cellen Isolering Laboratory vid UIC för holme isolering. Pankreasöarna var isolerade med UIC-metoden, som är en modifierad version av den metod som ursprungligen beskrevs av Ricordi<em> Et al</em><sup> 8</sup>. Som beskrivits i del I: Matsmältning och Insamling av pankreas vävnad, var mänsklig bukspottkörteln trimmas, kanylerade, perfusion och smältas. Efter uppsamling och minst 30 minuters inkubation i UW-lösning, var den vävnad som ligger i cellen separator (COBE 2991, COBE, Lakewood, CO) för rening<sup> 3</sup>. Efter rening, holme avkastning (uttryckt som holme medel, iEQ), vävnad volym och renhet bestäms enligt standardmetoder<sup> 9</sup>. Isolerade öar odlades i CMRL-1066 medier (Mediatech, Herndon, VA), kompletterat med 1,5% humant albumin, 0,1% insulin-transferrin-selen (ITS), 1 ml Ciprofloxacin, 5 ml 1M HEPES och 14,5 ml 7,5% natriumbikarbonat i T175 flaskor vid 37 ° C över natten kultur innan holmar var transplanterade eller användas för forskning.
Protocol
Discussion
Trots betydande framsteg inom tekniken för mänskliga holmen isolering, holme ger fortfarande är mycket varierande och oförutsägbar. Rening av smält bukspottskörteln vävnad är avgörande för att återställa en tillräcklig isle massa efter framgångsrik enzymatisk spjälkning för transplantation. UIC rening metod rekommenderas eftersom en överlägsen återhämtning av mycket rent mänskligt holmar visades med hjälp av denna metod. Dessutom kan upp till 50 ml smält vävnad laddas i en enda Cobe köra för r…
Acknowledgements
Med stöd av grundarna från University of Illinois i Chicago samt Islet Cell Resource Center NIH bidrag (RFA-RR 05-003), den Christopher Foundation, Efroymson Foundation och Tellabs stiftelsen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech Inc | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
