İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür
Summary
, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu (Bölüm II: insan adacıklar arıtma ve kültür) için prosedürleri değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanarak.
Abstract
Tip 1 diyabet Yönetimi, yıl içinde 100 milyar dolar maliyet, hem birey ve toplum, külfetli. Glikoz izleme ve yeni insülin formülasyonları yaygın kullanımına rağmen birçok kişi hala yıkıcı ikincil komplikasyonlar gelişir. Pankreas adacık nakli, diyabetik hastalarda normal glukoz kontrolü yakın geri yükleyebilirsiniz<sup> 1</sup>, Yoğun insülin tedavisi ile ilişkili ciddi hipoglisemik atakların riski olmadan. Başarılı adacık nakli için yeterli adacık kitle sağlanması önemlidir. Ancak, donör özellikleri, organ temini ve korunması izolasyon sonucunu etkileyebilecek<sup> 2</sup>. University of Illinois at Chicago (UIC), gelişmiş bir arıtma degrade ile başarılı bir izolasyon protokolü geliştirdi<sup> 3</sup>. Bu program, 2004 yılı Ocak ayında başlayan ve 300'den fazla izolasyonların Kasım 2008'de yapıldı. Pancreata (UW, Wisconsin veya HTK Üniversitesi, Histidin-Triptofan Ketoglutarate), soğuk muhafaza çözümleri gönderildi<sup> 4-7</sup> Hücre İzolasyonu Laboratuvar adacık izolasyonu için UIC. Pankreas adacık Ricordi tarafından tanımlanan yöntem değiştirilmiş bir versiyonu olan UIC yöntemi ile izole edildi<em> Ve ark.</em><sup> 8</sup>. Olarak Bölüm: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon, insan pankreas, kesilmiş delikli, perfüze ve sindirilmiş oldu. Toplama ve UW çözüm inkübasyon en az 30 dakika sonra, arıtma için doku hücre ayırıcı (2991 COBE, COBE, Lakewood, CO) yüklenmiş<sup> 3</sup>. Ardından arıtma, adacık verim (adacık benzerleri, iEQ olarak ifade), doku hacmi ve saflık standart yöntemlere göre belirlenir.<sup> 9</sup>. İzole adacıklar CMRL-1066,% 1.5 insan albümini,% 0.1 'lik insülin transferrine selenyum (ITS) Siprofloksasin, 5 ml 1M Hepes, 1 ml ile desteklenen medya (Mediatech, Herndon, VA), ve 14.5 ml kültüre edildi T175 şişeler 7.5% Sodyum Bikarbonat, 37 ° C gecede kültür adacıkları nakledilen veya araştırma için kullanılan önce.
Protocol
Discussion
Insan adacık izolasyon teknikleri konusunda önemli gelişmeler olmasına rağmen, adacık verimi son derece değişken ve öngörülemez kalır. Arıtma sindirilir pankreas dokusu nakli başarılı enzimatik sindirim sonra yeterli bir isle kütlesi kurtarmak için çok önemlidir. Bu yöntemi kullanarak, son derece saf bir insan adacıklar üstün bir kurtarma gösterildi, çünkü UIC arıtma yöntemi tavsiye edilir. Ayrıca, 50 ml kadar sindirilmiş doku böylece insan adacıklar iskemi ile ilişkili yaralanma izola…
Acknowledgements
Adacık Hücre Kaynak Merkezi NIH hibe (RFA-RR 05-003), Christopher Vakfı Efroymson Vakfı ve Tellabs Vakfı olarak, Chicago Illinois Üniversitesi kurucu olarak tarafından desteklenen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech Inc | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
