Summary

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Published: May 26, 2009
doi:

Summary

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu (Bölüm II: insan adacıklar arıtma ve kültür) için prosedürleri değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanarak.

Abstract

Tip 1 diyabet Yönetimi, yıl içinde 100 milyar dolar maliyet, hem birey ve toplum, külfetli. Glikoz izleme ve yeni insülin formülasyonları yaygın kullanımına rağmen birçok kişi hala yıkıcı ikincil komplikasyonlar gelişir. Pankreas adacık nakli, diyabetik hastalarda normal glukoz kontrolü yakın geri yükleyebilirsiniz<sup> 1</sup>, Yoğun insülin tedavisi ile ilişkili ciddi hipoglisemik atakların riski olmadan. Başarılı adacık nakli için yeterli adacık kitle sağlanması önemlidir. Ancak, donör özellikleri, organ temini ve korunması izolasyon sonucunu etkileyebilecek<sup> 2</sup>. University of Illinois at Chicago (UIC), gelişmiş bir arıtma degrade ile başarılı bir izolasyon protokolü geliştirdi<sup> 3</sup>. Bu program, 2004 yılı Ocak ayında başlayan ve 300'den fazla izolasyonların Kasım 2008'de yapıldı. Pancreata (UW, Wisconsin veya HTK Üniversitesi, Histidin-Triptofan Ketoglutarate), soğuk muhafaza çözümleri gönderildi<sup> 4-7</sup> Hücre İzolasyonu Laboratuvar adacık izolasyonu için UIC. Pankreas adacık Ricordi tarafından tanımlanan yöntem değiştirilmiş bir versiyonu olan UIC yöntemi ile izole edildi<em> Ve ark.</em><sup> 8</sup>. Olarak Bölüm: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon, insan pankreas, kesilmiş delikli, perfüze ve sindirilmiş oldu. Toplama ve UW çözüm inkübasyon en az 30 dakika sonra, arıtma için doku hücre ayırıcı (2991 COBE, COBE, Lakewood, CO) yüklenmiş<sup> 3</sup>. Ardından arıtma, adacık verim (adacık benzerleri, iEQ olarak ifade), doku hacmi ve saflık standart yöntemlere göre belirlenir.<sup> 9</sup>. İzole adacıklar CMRL-1066,% 1.5 insan albümini,% 0.1 'lik insülin transferrine selenyum (ITS) Siprofloksasin, 5 ml 1M Hepes, 1 ml ile desteklenen medya (Mediatech, Herndon, VA), ve 14.5 ml kültüre edildi T175 şişeler 7.5% Sodyum Bikarbonat, 37 ° C gecede kültür adacıkları nakledilen veya araştırma için kullanılan önce.

Protocol

1. Adacık saflaştırılması Adacık arıtma işlemi başlatmak için, COBE çanta yüklemek yeşil tüp hariç tüm tüpler kelepçe ve 0 1.500 için hızını ayarlamak ve süper. Kaputun pompa ve degrade bardak kurma ve toplama boru yeşil tüpüne bağlamak. : "Spin" sonra ön behere 110 ml Ficoll 1.100 itin ve COBE çanta yüklemek için pompa start Şimdi Ficoll 1.100 yükleme başlayabilirsiniz. Ficoll yüklü olduğundan, süper dışarı basın durdurmak pompa, pompa k…

Discussion

Insan adacık izolasyon teknikleri konusunda önemli gelişmeler olmasına rağmen, adacık verimi son derece değişken ve öngörülemez kalır. Arıtma sindirilir pankreas dokusu nakli başarılı enzimatik sindirim sonra yeterli bir isle kütlesi kurtarmak için çok önemlidir. Bu yöntemi kullanarak, son derece saf bir insan adacıklar üstün bir kurtarma gösterildi, çünkü UIC arıtma yöntemi tavsiye edilir. Ayrıca, 50 ml kadar sindirilmiş doku böylece insan adacıklar iskemi ile ilişkili yaralanma izola…

Acknowledgements

Adacık Hücre Kaynak Merkezi NIH hibe (RFA-RR 05-003), Christopher Vakfı Efroymson Vakfı ve Tellabs Vakfı olarak, Chicago Illinois Üniversitesi kurucu olarak tarafından desteklenen.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Centrifuge equipment Beckman Coulter 424803  
Cobe 2991 Cell Processor equipment Gambro. BCT 2556 islet purification
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Diagnostic Instrument Co 4103  
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nunc Brand Products 174926 islet counting
Digital Sight DS L1 equipment Nikon 217267  
COBE bag disposable equipment O.R. Solution 66707003  
T175 culture flask disposable equipment Sarstedt 83.1812.500  
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06  
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech Inc 99-597-CM  
Ficoll 1.100 reagent Bichrom AG L6155  
M199 media (wash solution) reagent Mediatech Inc 99-784-CM  
Final wash/Culture Medium reagent Mediatech Inc 99-785-CV  
Dithizone reagent Sigma D5130  

Play Video

Cite This Article
Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).

View Video