의 준비 Aplysia 감각 - 모터의 연결을 셀 문화

Summary

의 주요 문화

Abstract

해양 연체 동물 Aplysia californica의 신경계는 약 20,000 뉴런으로 구성된, 비교적 간단합니다. 뉴런은 별개의 크기, 형태, 위치 및 pigmentations과 함께, 대형 (직경에 1 ㎜)과 식별되며, 세포 기관은 외부 동물의 체내 분산 오 이점의 신경에 노출됩니다. 이러한 속성은 동물 ¹ 특정 동작을 기본 회로를 윤곽을 그리다하기 위해 조사를 허용합니다. 감각과 운동 뉴런 사이의 monosynaptic 연결 동물의 길 - 철수 반사의 중심 구성 요소, 동물이 사이펀의 촉각 자극에 대한 응답으로의 길을 철회하는 간단한 방어 반사합니다. 이 반사는 sensitization, 요법 이니, 그리고 고전적인 컨디셔닝을 포함하는 비 - 연관과 연관 학습의 형태를 겪습. 잘 특징 자극이 동물 ^2,3의 행동에 직접적으로 상호를 소성의 형태를 이끌어내는 어디 시냅스 소성의 연구에 특히 이익, 감각 모터 버렸네는 문화의 재구성 수 있습니다. 특히 세로토닌의 응용 프로그램은 시냅스, 응용 프로그램 프로토콜에 따라, (단기 촉진) 분 지속 강화, 시간 (중급 단기 촉진) 또는 일 (장기 촉진) 생산하고 있습니다. 대조적으로, 펩티드 송신기 FMRFamide의 응용 프로그램은 응용 프로그램 프로토콜에 따라 일 분 (장기 우울증)에서 지난 수 시냅스 약화이나 우울증을 생산하고 있습니다. 뉴런의 큰 크기는 표현 벡터, siRNAs 및 특정 신호 폭포와 분자를 대상으로하는 다른 화합물의 microinjection 함께 일 기간 동안 시냅스 강도의 반복 sharp 전극 기록을 허용함으로써 변경 사항을 기초 분자 및 세포 생물 학적 단계를 식별 시냅스 효능 인치

Aplysia 문화 시스템의 추가적인 장점은 뉴런 문화 ^4,5에서 버렸네 - 특이성을 보여주는 사실에서 비롯됩니다. 따라서, 감각 뉴런은 스스로 (autapses) 또는 다른 감각 뉴런과 시냅스를 형성하지 않으며 그들은 문화가 아닌 대상 확인된 모터 뉴런과 시냅스를 형성 않습니다. varicosities, 감각과 운동 뉴런 사이의 시냅스 접촉 사이트, 대상 모터 뉴런과 버렸네 형성은 (뿐만 아니라 시냅스 형태의 변화) 빛의 미세한 수준에서 공부 할 수 있도록 충분한 (직경 2-7 미크론) 큽니다.

이 비디오에서는, 우리는 그들의 신경, 신경의 테아제 소화, microdissection에 의해 결합 조직의 제거, 감각 및 운동 신경 및 제거 모두의 신분을 해부, anesthetizing 성인 및 청소년 Aplysia 포함한 감각 - 운동 신경 세포의 문화를, 준비의 각 단계를 보여주는 microdissection 각 세포 유형의 모터 신경 세포, 감각 neurite의 감각 신경 세포 및 조작의 이외의 도금은 교양 모터 신경 세포와 접촉을 형성합니다.

Protocol

준비 (솔루션 구성을위한 프로토콜의 끝에있는 솔루션 섹션을 참조)

1. 문화 요리를 준비합니다. 폴리 - L - 라이신 (나트륨 borate에서 만든)로 Mattek 유리 바닥 문화 요리 잘 코트 유리. 완전히 잘 유리를 커버하고> 1 시간 (야간 왼쪽 수)에 남길만큼 추가합니다. 철저하게 폴리 - L - 라이신은 인공 바닷물에서 (ASW) 4-5 번 rinsing하여 제거합니다. 마지막 헹굼 제거한 후, 2 50% L15의 MLS (소금과 보충과 2mM의 최종 농도에서 L - 글루타민을 포함) / 50 % hemolymph를 추가합니다. 이 문화 매체 전에 도금 세포에 적어도 한 시간 동안 접시에 있어야합니다 수 있도록 hemolymph의 외투 요리.
2. 에탄올과 함께 도구와 Sylgard 요리를 청소, ddH ₂ 0과 철저히 그들을 씻어 후 문화 후드의 자외선 아래에서> 1 시간 그들을 놓으십시오.
3. 뉴런의 microdissection에 대한 날카로운 전극을 준비합니다. microelectrode의 풀러 (예 : 브라운 P - 97을 플라밍 서터)는, 1.5 mm 외경, 0.86-1.12 mm 내경 및 100mm의 길이로 유리 피펫의 전극을 당겨 사용 (예 : 시스템 카탈로그 # 628000 AM, 세계 정밀 계측기 TW150 - 4, 1.55 / 1.12). 솔루션에 배치 액체에 대한 모세관 흡입이없는 그러한 높은 저항의 긴 위스피 좋은 팁과 전극을 생산 매개 변수를 사용합니다. 유체의 초승달 모양의 존재는 전극 팁은 고립 동안 신경 세포를 손상된다는 것을 의미합니다. 서터 전극 요리책은 전극 프로그램을 설정하기위한 훌륭한 지침을 제공합니다. 우리는 상자 필라멘트를 사용하고, 한 단계는 문화 전극을 생성 가져옵니다.
4. 마취 용액 (0.35M MgCl2), 문화 매체 (L15 소금과 hemolymph와 보충), 그리고 프로 테아제 솔루션 (10 단위 / ML의 최종 농도 1퍼센트 프로 테아제를 입력 IX, 시그마, 1 단위 / MG) 준비.
5. 동물 : 감각 뉴런의 고립과 LFS 모터 뉴런의 성인 80~100g Aplysia을 사용합니다. L7 모터 뉴런의 절연을위한 청소년 1-4그램 Aplysia을 사용합니다. 해수 탱크에서 부드럽게 동물을 제거하고, 마취 문화 절차를 시작하기 전에 더 이상 30 분 해수 (비커, 양동이 또는 비닐 봉투)에 유지합니다.

문화 절차

80~100g Aplysia에서 A.의 Culturing 가슴막안 감각 뉴런

1. 신경의 제거를위한 동물을 마취 : 18 게이지 1.5 인치 바늘로 60 ML의 주사기를 사용하여 성인 Aplysia (80-100g)에 0.35 M MgCl _2를 주사. 약 35 도의 각도로 동물의 발을 입력하고 너무 깊게 입력하지 마십시오. 목표는 내부 장기를 관통하지 않고 동물의 hemocoel에 주입하는 것입니다. 동물은 매우 커지는 편안한 될 것입니다.
2. 신경을 해부하다 : 머리와 꼬리에 핀 (18 게이지 바늘이 80-1백g 동물에 대한 잘 작동), 최대 직면하고있는 발, 해부 접시에 anesthetized 동물을 핀. 톱니 집게와 다리를 잡고 수술 가위로 피부와 기본 결합 조직 기슭의 전체 길이 (꼬리 머리부터)를 통해 했네요. 아래의 양면을 핀. 포셉 및 가위를 사용하여 식도를 잘라와 신경을 노출하는쪽으로 당기십시오. 좋은 포셉, 고급 가위를 사용하여 흉막 페달 신경을 (감각 뉴런은 흉막 신경에) 도려. 이 쉽게 단백 분해 효소 치료 후 신경을 핀 수 있습니다 이후 신경의 공정한 금액을 둡니다.
3. 신경의 테아제 소화 : 프로 테아제 플레이스 솔루션에 신경 (10 L15 1 단위 / MG의 MG / ML) 34.5에서 보육 세트 ° C (34-35 ° C 괜찮아요) 2 시간 및 15하십시오. 멋진 팁을 사용하면 세 번 전송 ASW에 신경을 씻어 포셉. L15에 신경 보관하십시오. 프로 테아제의 배양 시간이 다를 수 있습니다. 목적은 결합 조직을 쉽게 제거할 수 있도록하는 것입니다. 그것이 신경을 손상하지 않고 desheath 신경을 너무 어려운 경우, 프로 테아제의 배양 시간을 향상시킬 수 있습니다. 그것이 desheath 매우 쉬운 경우에는 신경 및 신경이 "소프트"프로 테아제의 배양 시간을 줄일 수 있습니다.
4. 신경을 Desheathing : 60 mm 또는 sylgard 및 L15을 포함 35mm 요리로 프로 테아제 - 소화 신경을 전송합니다. 스테레오 현미경 (외부 할로겐 조명과 함께) 아래보기, 제거 신경을 페달과 곤충 핀 및 벌금 집게를 사용하여 적절한 방향 Sylgard 접시에 흉막 신경을 핀. 좋은 포셉와 바나 외과 가위로 조심스럽게 결합 조직을 채취해서 그것이 감각 클러스터를 노출 그만 하죠. 절대 만지거나 somata의 연결을 손상하지 않도록주의하십시오. 접시에서 초과 결합 조직을 제거하고 공기에 desheathed 신경을 노출하지 않도록해야하고, 더 많은 매체를 추가하십시오. 감각 클러스터는 40-50 마이크론 직경의 약 200 클러스터된 뉴런으로 구성되어 있습니다. gangl에서 가까운 거리에서 "게시"를 만들기 위해 핀 설정이온 (보기의 필드 이내).
5. 뉴런의 절연 : 길고 날카로운 유리 문화 전극을 사용하면, 멀리에서 축삭과 함께 확인 뉴런 단지 중심에서 셀 몸을 만지 (찌르려고하지 않음) 천천히 그리고 꾸준히 세포 소마를 당기는하여 하나씩 꺼내 신경절. 부드럽게 전극에서 뉴런을 이동시키다하는 핀을 반대 누릅니다.
6. 도금 뉴런이 : 문화 접시에 Sylgard 요리에서 개별 뉴런을 전송 pipetman (P10)을 사용합니다. 플라스틱 팁이 hemolymph로 코팅되어 있도록 팁에 뉴런, pipet 문화 미디어를 전송하기 전에 (이것은 플라스틱으로 고집에서 뉴런을 방지). 모든 기포 또는 어떤 극단적인 세력 (즉, 아주 부드럽게 차지하고 pipetteman에서 뉴런을 제거)에 신경을 노출 방지에 큰 관심을 가지고. 골고루 음식을 통해 뉴런를 배포합니다. 똑바로 프로세스 부드럽게하기 위해 날카로운 전극을 사용하고 아래로 그들을 누릅니다.
7. 부화 : 3 시간 이하 이하 실온에서 현미경 무대에서 요리를 둡니다. 우리는 일상적으로 하룻밤을 두십시오. 현미경 스테이지가이 기간 동안 교란되지 않은 있는지 확인합니다. 빛과 보호하기 위해 알루미늄 호일로 무대를 커버. 부드럽게 18 ° C 배양기로 전송할 수 있습니다.
8. 문화는 대략 3 시간 이내에 접시를 준수해야하고 새로운 neurite 성장은 약 6-12 시간 이내에 표시되어야합니다. 격리된 감각 뉴런의 성장 DIV 3 또는 4의 고원에 도달합니다. 격리된 감각 뉴런도 아닌 형태 autapses 또는 서로 화학 시냅스, 그들은 양식 전기 갑 분기점을 비록합니다.

감각 뉴런 - 모터 뉴런 cocultures의 B. 준비

감각 뉴런은 문화 대상 모터 뉴런과 버렸네를 형성하고 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 모터 뉴런은 복부 신경절에서 LFS 모터 뉴런과 L7 모터 신경 세포입니다. LFS 모터 뉴런은 성인 (80~1백그램) Aplysia에서 고립, 그리고 복부 신경절 당 약 20 LFS 모터 뉴런이 있습니다. L7 모터 신경 세포는 청소년 (1-4 G) 동물로부터 격리하고, 복부 신경마다 하나의 L7가입니다. LFS 모터 뉴런은 직경 40-50 미크론있는 복부 신경의 복부 표면에 사이펀 신경의 루트에 가까운 르 감각 뉴런 사이에 interspersed이며, 각 소마의 미묘한 어두운 안료 명소 특징으로하고 있습니다. L7 모터 신경 세포의 직경은 100-150 마이크론이며 신경절의 왼쪽 중앙 가장자리에있는 신경절의 등의 표면에 존재합니다. 그것이 LFS 운동 뉴런을 사용하는 것이 더 경제적이지만, L7 모터 신경 세포의 대형 어떤 실험 유리한 것입니다. 또한, L7에 꼬리 복부 신경절의 지느러미 왼쪽 표면에 L11 모터 뉴런은, nontarget 모터 뉴런이고 효과적으로 감각 신경 세포가 fasciculates하지만 화학 시냅스를 형성하지 않는가있는 컨트롤로 사용할 수 있습니다.

1. 신경의 제거를위한 동물을 마취. LFS 모터 뉴런에 같은 흉막 감각 뉴런에 설명 않습니다. L7 모터 뉴런 들어, 21 게이지 바늘로 10 ML의 주사기를 사용하여 청소년 Aplysia (1-4 G)에 0.35 M MgCl _2를 주입.
2. (청소년 동물에 대한 21 게이지 바늘을 사용하여) 위에 설명된대로 해부 접시에 anesthetized 동물을 핀 : 복부 신경을 해부하다. 좋은 포셉, 고급 가위를 사용하여 복부 신경을 잘라 버릴거야.
3. 신경의 단백 분해 효소는 소화가 : 이것은 소화 시간이 소년 (1-4 G) 동물에서 신경에 대한 1 시간 45 분으로 감소 것을 제외하고, 흉막 감각 뉴런에 설명된대로 이루어집니다.
4. 신경을 Desheathing : sylgard하고 L15가 포함된 35 또는 60mm 요리로 프로 테아제 - 소화 신경을 전송합니다. 곤충 핀 및 벌금 집게를 사용하여 적절한 방향 Sylgard 접시에있는 신경에​​ 스테레오 현미경 (외부 할로겐 조명 포함) 아래에 내려보기. 좋은 포셉와 바나 외과 가위로 조심스럽게 결합 조직을 채취해서 그것이의 연결을 세포 기관을 폭로 했네요. LFS 모터 뉴런을 분리하려면, 복부 표면가 직면되도록 신경을 핀, 그리고 집게로 LFS 모터 뉴런 (오른쪽으로), desheath을 포함하고있는 신경절의 전체 절반을 노출 다시 결합 조직의 피복을 당겨 신경절의 나머지 부분은 요리의 모든 결합 조직을 제거하고 더 L15를 추가합니다. L7 또는 L11 운동 신경 세포를 분리, 등 부분의 표면가 직면되도록 신경을 핀, 그리고 집게로 L7과 L11 (왼쪽)를 모두 포함하는 신경절의 절반을 폭로 다시 결합 조직의 피복을 가져옵니다. 절대 만지거나 somata의 연결을 손상하지 않도록주의하십시오. 신경절에서 가까운 거리 (보기의 필드 이내)에서 "게시"를 만들어 핀을 놓습니다.
5. 뉴런의 절연 : 같은 감각 뉴런에 설명된 날카로운 전극과 뉴런을 제거합니다. LFS의 뉴런은 비교 아르자신의 somata의 작은 어두운 안료 명소에 기초하여 이웃 르 감각 뉴런에서 erentiated. L11은 L7에 꼬리 때문에 L7 셀 몸이 둥글게 만드는 동안 L11 셀 몸이 모양에 더 많은 오블롱 때문에 그리고 L11의 축삭은 세포에 두 가까이로 분기하는 경향이 있기 때문에 L7 신경 세포는 먼저 L11 신경 세포에서 차별화된 수 몸.
6. 도금 뉴런 :이 감각 뉴런에 설명된대로 문화 접시에 Sylgard 요리에서 개별 뉴런을 전송 pipetman (P10)을 사용합니다.
7. 감각 뉴런과 페어링하는 것은 : 모터 뉴런은 적어도 1 시간을위한 문화 접시에 충실하자. 다음 고립된 감각 뉴런은 도금 모터 신경 세포에 인접한 각 감각 신경 세포를 제공, pipetman로 추가합니다. 날카로운 유리를 사용하면 신중하게 동등하거나 감각 세포 축삭의 길이보다 약간 더 적은 거리, 감각 신경 세포의 축삭을 평탄케하고, 모터 신경 옆에 위치로 감각 세포 본문을 동축 케이블 전극. 유리 전극을 사용하여 감각 축삭 결국 감각 축삭 물리적 모터 신경 세포의 축삭에 문의하도록 테이퍼 전극의 측면을 사용하여 매우 부드럽게, 모터 신경 세포와 접촉으로 올 동축 케이블. 문화 요리 리프트, 오히려 부드럽게 현미경 단계 따라 접시를 활강하지 마십시오.
8. 로 감각 뉴런에 설명되어 이하 3보다 시간과 18 ° C 배양기로 전송하기 위해 상온에서 현미경 무대에서 요리를 둡니다.
9. 문화는 대략 3 시간 이내에 접시를 준수해야하고 새로운 neurite 성장은 약 6-12 시간 이내에 표시되어야합니다. 감각 뉴런은 매우 신속하게 모터 뉴런과 시냅스를 형성 glutamatergic - 세포 날카로운 전극 기록 (3-5 시간), 흥분성의 시냅스 후 전위가 기록될 수를 수행하기에 충분한 자기편 아르 마자. 시냅스 연결 DIV 3 시까지 계속 증가하고 DIV7 때까지 안정됩니다. 뉴런은 문화의 첫 번째 1~3일 동안 정교한 neurite의 파생물을 표시해야합니다.

Hemolymph의 C. 준비

Hemolymph는 Aplysia 문화에서 성장 인자 (포유 동물 세포 배양에 소태아 혈청의 사용에 유사)로 사용됩니다. 그것은 대형 (500g - 1kg) 동물에서 수집하고, (anecdotally) hemolymph를 수집하는 가장 좋은 시간은 봄 (6 월 중순 ~ 3 월) 동안입니다. 동물의 단지 작은 부분이 노출되도록 일회용 underpad에서 동물을 배냇저고리, 에탄올과 피부의 부분을 청소하고 다른 사람이 노출된 지역에 절개를 만들기 위해 멸균 면도날을 사용하는 동안 잠깐. 깨끗한 비커로 hemolymph의 squirts, 그건 동물의 더러운 피부를 접​​촉하지 않도록해야 할 수 있도록 동물을 묶어라. hemolymph은 동물의 hemocoel (즉, 동물이 기본적으로 hemolymph의 색입니다) 채워집니다. (이것은 오염되어있다면, 첫 번째 컬렉션 여전히 유용 있도록 새로운 비커에 수집) 새로운 절개를하고 최대한 많은 hemolymph를 수집하기 위해 열심히 짠다, 한두 번 동물을 Rewrap. 각 동물의 Hemolymph는 (즉, 다른 동물의 풀 hemolymph하지 않습니다) 별도로 보관해야합니다. 혈액 세포를 제거하는 10 분 2000 XG에서 hemolymph를 스핀. 10 ML의 aliquots에서 나누어지는 뜨는, -80에서 동물과 가게에 라벨 ° C. -20 ° C에 저장된 hemolymph 중간에 침전물을 형성합니다. hemolymph의 새로운 나누어지는는 때마다 문화 매체가 준비가되어 있습니다 사용해야하고, 나누어지는가 매체를 준비하기 직전 해동해야합니다. 해동 후 refreeze하지 마십시오.

Discussion

그것은 스테레오 현미경을 통해 볼 개별 뉴런의 microdissection 및 조작과 관련된 미세 모터 기술의 개발과 관련된 이후 Aplysia 감각 모터 문화의 성공적인 준비는 다소 느린 학습 곡선이 있습니다. 우리의 경험에서는 모터 뉴런과 감각 뉴런을 쌍으로하는 방법에 대한 자세한 내용은 문화의 건강한 고립 감각 뉴런과 추가 1~3주를 얻는 연습의 약 1-3주 걸립니다. 그 동안 현미경이 culturing (임의의 진동 또는 기계적 교란 준수에서 뉴런을 방지) 동안 교란되지 않은 한, 모든 실험실 벤치이나 책상에 그들을 준비 할 수 있지만 우리는 정기적으로, Labconco 클린 벤치에서 문화를 준비합니다. 뉴런은 18 해수의 성장 이후 ° C, 세균 및 곰팡이 contaminations는 포유류의 세포 배양에 비해 훨씬 많이 있습니다. 문화 준비에서 가장 중요한 변수는 동물의 품질입니다. Aplysia가 하나 태평양 (민활, 또는 마리), 또는 번식 쌍 수집 마이애미 Mariculture 시설, 대학에서 직접 수집 업체에서 구입하실 수 있습니다 태평양에서 그리고 한번 번식주기를 통해 Aplysia을 자랍니다. 따라서, 동물 유전자 이기종 있으며, 바다에서 수집한 동물의 경우, 그들은 그들의 환경 역사의 관점에서 또한 불일치 있습니다. 최악의 기간은 보통 8 월에 발생과 Aplysia에서 얻은 뉴런의 질에 어떤 계절,, 12까지 다른 낮은 품질의 기간이 있습니다. 또 다른 중요한 변수는 hemolymph입니다. 그것은 그들의 성장 촉진 용량 hemolymph의 다른 배치를 테스트하고, 실험의 집합에 대한 hemolymph 같은 일괄 처리를 사용하는 것이 현명하다.

Aplysia의 연결 문화를 준비 어려움에도 불구하고, 그들은 버렸네 형성하고 시냅스 소성의 연구에 독특하고 가치있는 장점 번호를 보유하고 있습니다. 그들은 일 기간 동안 날카로운 전극 기록에 의해 모니터할 수 있습니다 문화 monosynaptic 연결을 형성합니다. 그럼 특징 프로토콜은 동물의 행동에서 분명 평행선을 소성의 형태를 이끌어내는 것이 존재합니다. 자극은 목욕이나 synapses6의 일부, 7에 적용할 수 있으며, 문화의 지오메 트리는 다양한 수 있도록 한 감각 신경 세포 접촉 하나의 모터 신경 세포, 또는 bifurcated 축삭 연락처 하나의 감각 신경이 운동 신경 또는 감각이 뉴런은 개별 모터 신경 세포에 문의하십시오. 분자 및 세포 생물 학적 경로는 DNA, RNA, siRNA와 다른 시약의 microinjection하여 개별 뉴런으로 변경될 수 있으며,의 연결 구조와 기능, 신경 전송 및 소성에 대한 효과는 시간적 및 공간적 해상도로 모니터링할 수 있습니다. NIH와 브로드 연구소, Aplysia 게놈의 순서의 완료를 어떤해야 끝마치기 직전입니다

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.