Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen
Summary
In diesem Video stellen wir Ihnen die<em> Ex vivo</em> Erzeugung und Erweiterung des menschlichen CD40-aktivierten B-Zellen (CD40-B) aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) durch Stimulation mit CD40-Ligand und Interleukin-4.
Abstract
CD40-aktivierte B-Zellen (CD40-B-Zellen) wurden als eine alternative Quelle für immunstimulierende Antigen-präsentierende Zellen (APC) für die Immuntherapie von Krebs 3.1 identifiziert worden. Im Vergleich zu Dendritische Zellen (DCs), den am besten charakterisierten APC, CD40-B-Zellen haben mehrere verschiedene biologische und technische Eigenschaften. Ähnlich wie DCs, B-Zellen eine erhöhte Expression von MHC-und kostimulatorischen Molekülen (Abb. 1b) zeigen, weisen eine starke Wanderungsbewegungen Kapazität und präsentieren Antigen-Präsentation effizient auf T-Zellen nach Stimulation mit Interleukin-4 und CD40-Ligand (CD40L). Doch im Gegensatz zu unreifen oder reifen DCs, Express-CD40-B-Zellen die volle Lymphknoten Homing Triade bestehend aus CD62L, CCR7/CXCR4 und Leukozyten-Antigen-Funktion-1 (LFA1, CD11a/CD18), die für Homing zu sekundären lymphatischen Organen (Abb. 1a) 3. CD40-B-Zellen können ohne Schwierigkeiten aus sehr geringen Mengen im peripheren Blut, die weiter in vitro werden, um sehr große Mengen an hochreinen CD40-B-Zellen (> 10 9 Zellen pro Patient) von gesunden Spendern sowie Krebs kann erweitert erzeugt werden Patienten (Fig.1c, d) 1,4.
In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie voll aktiviert CD40-B-Zellen aus humanen PBMC erhalten. Key-Moleküle für die Zellkultur sind CD40-Ligand, Interleukin-4 (IL-4) und Cyclosporin A (CsA), die in einer 3-4 Tage alten Kultur-Zyklus wieder aufgefüllt werden. Für Laborzwecke CD40-Stimulation wird durch NIH/3T3-Zellen exprimierenden rekombinanten humanen CD40-Liganden (tCD40L NIH/3T3) 5 zur Verfügung gestellt. Zur Vermeidung von Kontaminationen mit nicht-transfizierten Zellen ist die Expression des humanen CD40-Liganden auf die Transfektanten regelmäßig überprüft werden (Abb.2).
Nach 14 Tagen CD40-B-Zell-Kulturen bestehen aus mehr als 95% reinen B-Zellen sowie eine Ausweitung des CD40-B-Zellen über 65 Tage ist oft möglich, ohne Verlust der Funktion 1, 4. CD40-B-Zellen effizient aufnehmen, verarbeiten und präsentieren Antigene an T Zellen 6. Sie haben nicht nur prime naϊve, sondern auch zu erweitern Memory T-Zellen 7,8. CD40-aktivierte B-Zellen können verwendet werden, um B-Zell-Aktivierung, Differenzierung und Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus stellen sie ein vielversprechendes Werkzeug für therapeutische oder präventive Impfung gegen Tumoren 9.
Protocol
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| DMEM-Ham’s / F12 | DMEM-Ham’s / F12 | ||
| L-Glutamine | 365 μg/mL | L-Glutamine | 365 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| G-418 | 0.7 mg/mL | ||
| CD40-B washing medium | CD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| IMDM | |
IMDM | |
| L-Glutamine | 584 μg/mL | L-Glutamine | 584 μg/mL |
| HEPES | 25 mM | HEPES | 25 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| rh Transferrin | 50 μg/mL | ||
| rh Insulin | 5 μg/mL | ||
| AB-Humanserum | 10 % | ||
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| DMEM / Ham’s F12 | PAA | Cat No: E15-813 |
| IMDM | Invitrogen Gibco® | REF 21980-032 |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| AB-Human Serum | Invitrogen | Cat No 34005100 |
| holo-Transferrin human | Sigma | Cat No T0665 |
| Insulin human | Sigma | Cat No I2643 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| Recombinant Human Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| G-418 Sulphate | PAA | Cat No P02-012 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | SARSTEDT | Cat No 83.1813.002 |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
- Bergwelt-Baildon, M. v. o. n. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
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