Het verkrijgen van zeer zuivere Toxoplasma gondii Oöcysten door een discontinue Cesium Chloride Gradient

Summary

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een aangepaste CsCl methode die gemakkelijk T. gondii oöcysten zuivert van uitwerpselen van geïnfecteerde katten die geschikt zijn voor moleculair-biologische en weefselkweek manipulatie

Abstract

Toxoplasma gondii is een obligaat intracellulaire protozo ziekteverwekker die vaak infecteert mensen. Het is een goed gekarakteriseerde apicomplexan in verband met het veroorzaken van voedsel-en water-gedragen ziekte-uitbraken. De definitieve gastheer is de kat soort waar seksuele replicatie plaatsvindt resulteert in de ontwikkeling van de zeer besmettelijke en milieuvriendelijk bestendig oocysten. Besmetting vindt plaats via inname van weefsel cysten van besmet vlees of oöcysten uit de bodem of water. Infectie is meestal asymptomatisch bij gezonde personen, maar resulteert in een levenslange latente infectie die kan activeren waardoor toxoplasmic encefalitis en de dood als het individu wordt verzwakt immuunsysteem. Vlees besmet met T. gondii cysten zijn de primaire bron van besmetting in Europa en de Verenigde Staten, maar de recente veranderingen in het diermanagement en veehouderijpraktijken en verbeterde voedingsmiddelen en-verwerking procedures aanzienlijk verminderd de prevalentie van T. gondii cysten in vlees ^{1, 2.} Toch seroprevalentie in de mens blijft relatief hoog wat suggereert dat de blootstelling van oocysten verontreinigde grond of water waarschijnlijk is. Sterker nog, watergedragen uitbraken van toxoplasmose gemeld wereldwijde ondersteuning van de theorie van de blootstelling aan de milieu-oocysten formulier vormt een belangrijke risico voor de gezondheid ^3-5. Tot op heden is het onderzoek naar het begrijpen van de prevalentie van T. gondii oöcysten in het water en het milieu zijn te wijten aan het gebrek aan tools om oöcysten te detecteren in het milieu ^{5, 6} beperkt. Dit is voornamelijk te wijten aan het ontbreken van een efficiënte zuivering protocollen voor het verkrijgen van een groot aantal zeer gezuiverd T gondii oöcysten van geïnfecteerde katten voor onderzoeksdoeleinden. Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een aangepaste CsCl methode die gemakkelijk zuivert T. gondii oöcysten uit uitwerpselen van geïnfecteerde katten die geschikt zijn voor moleculair-biologische en weefselkweek manipulatie ^7.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Algemene veiligheidsmaatregelen bij het werken met<em> T. gondii</em> Oöcysten</p><ol><li> Het is belangrijk om alle voorzorgsmaatregelen te volgen bij het werken met<em> T. gondii</em> Oöcysten. De meeste gezonde mensen,<em> T. gondii</em> Infectie gemakkelijk onder controle gehouden door het immuunsysteem, maar een levenslange infectie resultaten. Immuungecompromitteerde personen zijn bijzonder gevoelig voor toxoplasmose en mogen niet omgaan met<em> T. gondii</em> Oöcysten. Zwangere vrouwen moeten ook niet omgaan met<em> T. gondii</em> Oöcysten, omdat de infectie kan ernstige geboorteafwijkingen⁸.</li><li<em> T. gondii</em> Oöcysten mag alleen worden behandeld in een aangewezen gebied en met getraind personeel. Borden<em> T. gondii</em> Oocysten wordt gewerkt dient te worden geplaatst op anderen betreden het aangewezen gebied alert.</li><li> Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), zoals een labjas, wegwerp schort, wegwerp handschoenen, en een goede oogbescherming of een gelaatsscherm bij het hanteren van<em> T. gondii</em> Oöcysten.</li><li> Frequente handschoen veranderingen worden aanbevolen. Zijn er lab-apparatuur niet aan met<em> T. gondii</em> Oocysten verontreinigde handschoenen.</li><li> Gebruik altijd metalen autoclaveerbaar bakken bekleed met een disposable absorberend liners bij het werken met<em> T. gondii</em> Oöcysten. Zorg ervoor dat alle racks, buizen, enz. gebruikt worden ofwel wegwerp-of autoclaveerbaar.</li><li> Alle<em> T. gondii</em> Afval moet twee keer worden geautoclaveerd gedurende ten minste een uur.</li><li> Alle niet-disposable materiaal (rekken, bakken, enz.) moet ook twee keer worden geautoclaveerd gedurende ten minste een uur.</li><li> Vacuüm-lijnen gebruikt om vloeistoffen te zuigen moet worden aangesloten op een Vacushield ™ filter om verontreiniging van het vacuum pomp te voorkomen.</li><li> Alle betrokken laboratorium bench-tops moet worden ontsmet, na het voltooien van het werk met<em> T. gondii</em> Oöcysten. Vers gemaakte 10% hypochloriet moet royaal worden toegepast op het werkgebied en mogelijk droog. Het gebied moet dan goed worden gespoeld met water.</li></ol><p class="jove_title"> 2. De voorbereiding van de buffers en oplossingen</p><ol><li> Bereid een 1 L 2,2 M oplossing van sucrose door het oplossen van 752,66 g sucrose in 600 ml DDH₂ O. Roer voorzichtig en warmte met behulp van een verwarmde roer plaat om de sucrose te ontbinden. Eenmaal volledig is opgelost, breng het volume op een L met DDH₂ O. Dit moet worden gevolgd door sterilisatie in de autoclaaf de oplossing ten minste 20 minuten.</li><li> Bereid een 1L TE-buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), pH 7,2 door toevoeging van 6,05 g Tris-HCl en 3,7 g EDTA in 700 ml van DDH₂ O, breng de pH op 7,2 te brengen dan het volume op een L met DDH₂ O.</li><li> Voor de CsCl gradiënt, bereiden een voorraad oplossing van CsCl met een soortelijk gewicht van 1,15 (1,15-CsCl) door het toevoegen van 21,75 g van CsCl met 103,25 ml TE-buffer. Voor oplossing A, mix 30 ml van TE met 20 ml van 1.15-CsCl. Voor oplossing B, mix 20 ml van TE met 30 ml van 1.15-CsCl en 12,5 ul van fenolroodoplossing. Voor oplossing C, meng 10 ml van TE met 40 ml van de 1,15-CsCl (tabel 1).</li><li> Maak een 1L 1 N oplossing van natriumhydroxide (NaOH) door het oplossen van 40 g NaOH, in 800 ml van DDH₂ O. Eenmaal opgelost, breng het volume op een L met DDH₂ O.</li><li> Bereid een 1 L 2% (in volume) oplossing van H₂ SO₄ Mengen 20 ml H₂ SO₄ Met 980 ml van DDH₂ O.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Sucrose zweven</p><ol><li> Voeg 10 ml van een suspensie van fecale<em> T. gondii</em> Oöcysten, in 2% H₂ SO₄, In een 50 ml conische centrifugebuis. Opgemerkt moet worden dat de fecale suspensie verwijst naar de monsters die zijn pre-verwerkt door een sucrose flotatie procedure zoals eerder beschreven⁸. Wanneer de fecale monsters in eerste instantie worden geoogst van de geïnfecteerde katten die worden verwerkt door een sucrose zweven, zoals beschreven in referentie 8. Deze extra sucrose float is nodig om verder te minimaliseren fecale puin overgedragen naar de CsCl zuiveringsproces en de zuiverste verkrijgen<em> T. gondii</em> Oöcysten mogelijk te maken.</li><li> Neutraliseer de 2% H₂ SO₄ Door het toevoegen van 6 ml (3 / 5 volumes) van 1 N NaOH tot de fecale suspensie. Meng goed door vortexen.</li><li> Voeg een gelijk volume (16 ml) van 2,2 M sucrose het creëren van een uiteindelijke concentratie van 1,1 M om de uitwerpselen schorsing en meng goed door vortexen.</li><li> Voorzichtig overlay de sucrose / fecale suspensie met 10 ml DDH₂ O met behulp van een pipet van 10 ml. Centrifugeer de suspensie bij 1200 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur zonder rem.</li><li> Zorgvuldig verzamelen boven water en de interfase lagen en over te dragen aan een nieuwe 50 ml conische centrifugebuis door pipetteren van de lucht-water interface zonder wervelende de pipet. Het is belangrijk om sucrose overdracht te minimaliseren, terwijl het verzamelen van de interfase laag.</li><li> Meng de rest van sucrose / fecale pellet-oplossing door vortexen de buis.</li><li> Herhaal de stappen 3.4 en 3.5.</li><li> Breng het volume van de twee oocysten interfase oplossingen tot 50 ml met DDH₂ O en centrifugeer de buizen op 2.000 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li><li> Het supernatans van elke buis en resuspendeer pellets samen Zuig met 5 ml TE-buffer en het zwembad van het oocysten schorsing. Het totale volume gepoolde moet 10 ml zijn.</li></ol><p class="jove_title"> 4. CsCl gradiënt</p><ol><li> Bereid een discontinue CsCl gradiënt in een 50 ml polycarbonaat Oak Ridge buis door zorgvuldig onderliggende elke laag met behulp van een 50 ml spuit met een 18 gauge stompe, autoclaveerbaar, stalen naald, en een 2-weg stop pik. Let op: Fenolrood wordt toegevoegd aan Oplossing B gemakkelijk onderscheid te maken tussen de helling lagen (tabel 1).</li><li> Voeg langzaam de volgende oplossingen om de buis in de volgorde hieronder. Opgemerkt moet worden dat het debiet niet meer dan 0,5 ml / sec te overschrijden.<ol><li> 10 ml van de TE / oocysten schorsing monster</li><li> 8 ml Oplossing A</li><li> 8 ml Oplossing B</li><li> 8 ml Oplossing C</li></ol></li><li> Centrifugeer het Oak Ridge buis bij 12.000 xg gedurende 60 min bij 4 ° C zonder rem. Het gebruik van een vaste hoek rotor is acceptabel, maar een hoge snelheid swingende emmer resulteert in een betere scheiding van de oöcysten van de suspensie monster met een minimale fecale puin vlekken langs de zijkant of de buis. De omvang van de uitstrijkjes is afhankelijk van de samenstelling van de fecale suspensie en dus kan het nodig zijn om twee CsCl hellingen uit te voeren als de fecale suspensie is erg vuil.</li><li> Na centrifugatie, de ondoorzichtige / wit oocysten bevatten band tussen oplossingen A en B. verzamelen om besmetting met fecale puin te minimaliseren, ga direct naar de oocysten band zonder verstoring van de gradiënt en het verzamelen van de oocysten interfase met behulp van een pipet van 10 ml. Breng de oocysten interfase om een ​​nieuwe 50 ml conische centrifugebuis. Probeer om de hoeveelheid aangezogen CsCl oplossing te minimaliseren, terwijl het verzamelen van de oocysten interfase als het kan een probleem in pelleteren de oöcysten tijdens de wasstap pose.</li><li> Was oöcysten met 30-40 ml van DDH₂ O. Centrifugeer de buis bij 2000 xg bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met geen rem. Voorzichtig het supernatans aspireren zonder de oocysten pellet. Herhaal het wassen 2 keer extra.</li><li> Aan het einde van de laatste wassen, zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml 2% zwavelzuur en bewaren bij 4 ° C tot gebruik. Oöcysten zijn nu klaar voor verdere manipulatie. Oocysten zuiverheid kan microscopisch worden gecontroleerd door de afwezigheid van fecale puin in het monster.</li></ol