Summary
نقدم الرواية والتكامل قوية من nanophotonics (QD - الحنق) و microfluidics للتحقيق في تشكيل polyplexes polyelectrolyte ، والتي من المتوقع أن يوفر سيطرة أفضل وتوليف polyplexes موحدة وقابلة للحمض النووي في المستقبل على أساس المداواة.
Abstract
التقدم في علم الجينوم الاستمرار في تطوير وقود من العلاجات التي يمكن أن تستهدف المرضية على المستوى الخلوي والجزيئي. وظيفية عادة داخل الخلية ، حمض النووي القائم على العلاجات تتطلب كفاءة نظام توصيل الخلايا. أحد النهج المعتمد على نطاق واسع هو الحمض النووي معقد مع الجين الناقل للكهرباء من خلال النموذج nanocomplexes التجميع الذاتي ، وتسهيل امتصاص الخلوية من الحمض النووي في حين حمايته من التدهور. التحدي يكمن في تصميم الرشيد للناقلات الجينات كفاءة ، سابق لأوانه منذ تفكك أو ملزمة مستقرة بشكل مفرط سيكون ضارا لامتصاص الخلوية والنجاعة العلاجية. وأظهرت Nanocomplexes توليفها من قبل معظم خلط مجموعة متنوعة من السلوك داخل الخلايا التفريغ والاتجار بها ، والتي كانت تعزى إلى عدم التجانس في الحجم واستقرار nanocomplexes. عدم التجانس هذا يعوق تقييم دقيق لحركية التجميع الذاتي ، ويضيف إلى صعوبة في ربط خصائصها الفيزيائية إلى الكفاءة أو ترنسفكأيشن bioactivities. نقدم تقارب الرواية من nanophotonics (أي QD - الحنق) و microfluidics لتوصيف حركية في الوقت الحقيقي من nanocomplex التجميع الذاتي تحت التدفق الصفحي. QD - الحنق يوفر مؤشرا حساسة للغاية من ظهور التفاعلات الجزيئية ، وقياس الكمي في جميع مراحل عملية التجميع ، في حين يقدم على microfluidics المكروية التي تسيطر عليها بشكل جيد لتحليل عملية مكانيا مع القرار الزماني عالية (~ مللي ثانية). لنظام نموذجي للnanocomplexes البوليمرية ، تم القبض على مرحلتين متميزتين في عملية التجميع الذاتي من قبل هذه المنصة التحليلية. والجانب الحركي لعملية التجميع الذاتي التي تم الحصول عليها في microscale تكون ذات قيمة خاصة بالنسبة للmicroreactor المستندة ردود الفعل التي هي ذات الصلة لكثير من التطبيقات المتناهية الصغر والنانوية الحجم. كذلك ، قد تكون مخصصة nanocomplexes من خلال التصميم الجيد للأجهزة microfludic ، وما ينجم عن ذلك الحنق QD - DNA يمكن nanocomplexes البوليمرية تطبيقها بيسر لإقامة هيكل وظيفة العلاقات.
Protocol
ألف Biotinylation من الحمض النووي
وbiotinylated تساهميا DNA البلازميد مع تسميات البيوتين جوانين محددة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة (Mirus بيو ، ماديسون ، ويسكونسن) ، ولكن أن يكون تحجيم ~ 1-2 التسميات البيوتين في الحمض النووي. وكان المسمى DNA البلازميد (pEGFP - C1 ، 4.9 كيلوبايت ، Clontech ، ماونتن فيو ، كاليفورنيا) في هذا البروتوكول.
- حل المبلغ المطلوب في pDNA العازلة من الدناز TE - ريبونوكلياز حرة وخالية من (البيولوجيا الجزيئية الصف الجودة) المياه لجعل الحل 1μg/μL الحمض النووي.
- وسم سلوك رد الفعل باستخدام خليط التفاعل التالية. إضافة تسمية تكنولوجيا كاشف الماضي.
للتفاعل الحمض النووي 100μg :
| الدناز خالية والمياه الخالية من ريبونوكلياز | 75 ميكرولتر |
| 10X العازلة وصفها | 20 ميكرولتر |
| 1μg/μL الحمض النووي | 100 ميكرولتر |
| تسميته كاشف | 5 ميكرولتر |
| اجمالى حجم التداول | 200 ميكرولتر |
- احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تنقية عينة المسمى من قبل هطول الأمطار أو الإيثانول الأيزوبروبانول التالية البروتوكولات القياسية.
ملاحظة : الأعمدة الترشيح جل تستند قد يؤدي إلى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عالية أو الخلفية مضان ، والتي قد تؤثر على الحمض النووي أو التوصيف الكمي مضان.
ملاحظة : يمكن تحديد مستوى biotinylation بواسطة هبة القائم على الاختبارات.
باء وصفها من البوليمرات Cy5 - الكاتيوني
وقد استخدم الشيتوزان (390 كيلو دالتون ، 83.5 ٪ deacetylated ، Vanson ، ريدموند ، واشنطن) بوصفها نموذجا البوليمر الموجبة في هذه الدراسة. وكانت تسمية الأمينات الابتدائي المجاني على العمود الفقري البوليمر الشيتوزان مع NHS - Cy5 (أمرشام العلوم البيولوجية ، بيسكاتواي ، نيو جيرسي).
- لتسهيل تصريف كامل Cy5 صباغة ، وحساب مثل هذه النسبة من المولي Cy5 المبلغ المطلوب من NHS - Cy5 : الأمينات الأولية هي 1 : 200.
- ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل الشيتوزان (في المخزن خلات 25mM) إلى ~ 6.5 إضافة هيدروكسيد الصوديوم. علما بأن رد فعل NHS أكثر كفاءة في الرقم الهيدروجيني الأساسية ، ولكن ذوبان الشيتوزان هنا يحد من نطاق العمل الحموضة.
- مع التحريك ، إضافة ببطء المبلغ المحسوب Cy5 - NHS (1 ملغ / مل DMSO) إلى حل الشيتوزان بطريقة قطرة تلو قطرة.
- تستنهض الهمم الخليط في الظلام في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- لتنقية ، dialyze مع 10K MWCO الشرائح - A - Lyzer (بيرس) لمدة 2 ساعة عازلة ضد خلات 1 ٪ عند درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- استبدال العازلة وdialyze آخر ساعة 2 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- استبدال العازلة وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام.
- مخزن تنقية المسمى البوليمر في -20 درجة مئوية.
ملاحظة : في هذه الدراسة ، هي التي شيدت منحنى القياسية عن طريق قياس كثافة الانبعاثات من Cy5 NHS - استر في 670 نانومتر. تميز العلامات الكثافة من خلال قياس الانبعاثات في الحصول على 670 ميل بحري من الشيتوزان - Cy5 المسمى في منحنى القياسية. ويمكن أيضا أن تستخدم الامتصاصية لتحديد كفاءة التوسيم ولكن لم يتم تنفيذ هنا.
جيم إعداد QD التي تحمل علامات الحمض النووي وCy5 البوليمر
تم الإبقاء على نسبة من المولي لpDNA QD في الفائض (pDNA : QD ≈ 1 : 2) لضمان التصريف الكامل لQDs pDNA. ويمكن تقدير عدد QDs المسمى على كل pDNA من خلال التصوير TEM أو مرافق أخرى مماثلة. في دراستنا ، ويقدر عدد QDs في pDNA أن ~ 1-3 بواسطة تيم واحد الطيفي الجزيء. 1 استخدام المياه ميليبور التدرج الملة - Q (> 18.0 ميغاواط ، 0.2um تصفيتها) أثناء الإعداد.
- حساب المبلغ المطلوب من أجل الشيتوزان pDNA 10μg وفقا لنسبة N / P المرجوة ، فإن نسبة الأمينات البروتونية النظرية في حل الشيتوزان إلى الفوسفات السلبية في حل الحمض النووي.
- إضافة streptavidin - functionalized 605QDs (605 Qdot ITK ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) في حل pDNA biotinylated.
- احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة.
- إضافة QD التي تحمل علامات الحمض النووي في 50 ملي محلول كبريتات الصوديوم لجعل 200μL الحجم النهائي.
- تمييع Cy5 - الشيتوزان ، وفقا لنسبة N / P المطلوب ، مع ميلي - Q المياه لجعل 200μL الحجم النهائي.
ملاحظة : حافظ على رد الفعل في الظلام لمنع photobleaching ممكن.
المهم : كن حذرا في استخدام 605 Qdot ITK ™ streptavidin المتقارن (سلسلة ITK) ، كما تم تصميم نقاط الكم في هذا الكتالوج لغرض الحنق. سلسلة Qdot العادية هي مترافق مع طبقة الربط لمنع غير محددة وملزمة ، ولا سيما لوصفها الخلوية. ومع ذلك ، هذا الطلاء إضافية يوسع المسافة متقبل المانحين ، مما أدى إلى صeduced كفاءة الطاقة النقل.
دال التصنيع للاساتذة SU - 8 عن طريق الطباعة التصويرية قياسي
- سي الرقاقة البيرانا تنظيفها والمخبوزة في 200 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- للسمك الرئيسي المعين من 25μm ، ومعطف تدور مقاومة للضوء سلبي (SU - 8 2025 ، Microchem ، نيوتن ، ماجستير) على رقاقة سيليكون على 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
- لينة خبز الرقاقة على موقد مع منحدر من 65 درجة مئوية / ساعة إلى 95 درجة مئوية.
- تعرض للأشعة فوق البنفسجية (365nm) ل250mJ/cm 2 من خلال فيلم القناع (CAD / خدمات فنية ، باندون ، OR) الذي يحتوي على تصميم microchannels.
- بعد التعرض للخبز الرقاقة على موقد مع منحدر من 65 درجة مئوية / ساعة إلى 95 درجة مئوية.
- تطوير الرقاقة باستخدام SU - 8 المطور مقاومة للضوء.
- الثابت هو خبز الرقاقة منقوشة على موقد مع منحدر من 65 درجة مئوية / ساعة إلى 200 درجة مئوية. رقاقة في الحفاظ على 200 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 5 ساعات ، ثم تبرد تدريجيا وصولا الى رقاقة درجة حرارة الغرفة.
المهم : التعلية تدريجي خلال عملية SU - 8 الخبز الرئيسي هو ضروري ، وإلا فإن SU - 8 هيكل قد فصل من رقاقة السيليكون أو تشققات على SU - 8 قد يكون محرضا بواسطة بنية الإفراج الإجهاد.
هاء صب طبق من PDMS من سادة والترابط على الزجاج غطاء
- يوضع سيد SU - 8 في قارب وزنها.
- وكيل وعلاج الاستومر مزيج من السيليكون (بولي (dimethylsiloxane) ، PDMS ، Sylgard 184 ، داو كورننغ ، ميدلاند ، ميتشيغن) في 10 : 1 النسبة.
- يصب الخليط على PDMS سيد SU - 8 وترك القارب وزنها في مجفف فراغ لإزالة الفقاعات.
- علاج PDMS في 65 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعات.
- قشر الشريط PDMS من القالب الرئيسي سي.
- لكمة مداخل ومنافذ قناة الجهاز fluidic.
- تنظيف الشريط PDMS والزجاج مع تغطية الايثانول ثم الهواء الجاف.
- علاج تنظيف الشريط PDMS والزجاج غطاء البلازما مع الأكسجين (20W ل1min).
- على الفور السندات الشريط PDMS مع زجاج الغطاء.
- ترك شريحة ميكروفلويديك المستعبدين في الفرن على درجة حرارة 95 درجة مئوية ليلة وضحاها.
المهم : العلاج البلازما والخبز بين عشية وضحاها ضرورية لتعزيز قوة الترابط.
F. مراقب تشكيل Nanocomplexes الحمض النووي في الجهاز ميكروفلويديك
- ملء قناة ميكروفلويديك بالماء (لضمان عدم وجود فقاعات داخل القناة ميكروفلويديك) ، قبل تحميل الكواشف لضمان التدفق السلس أثناء التجربة.
- تحميل QD الحمض النووي المسمى والمسمى Cy5 حلول الشيتوزان الى قسمين المحاقن الزجاجية الفردية ، من خلال الأنبوب هو موضح في الفيديو.
- توصيل أنابيب مع اثنين من منافذ الأجهزة ميكروفلويديك. الحرص على عدم إدخال أي الهواء خلال هذه العملية. ضبط معدل التدفق في 20nL/min (الدكتوراه - 2000 ضخ حقنة ، Holliston ، MA) ، في ظل ظروف التدفق الصفحي.
- التحقق من microchannels تحت المجهر.
- عندما تدفق غير مستقرة (~ 15 إلى 20 دقيقة) ، QD بوساطة الحنق ينبغي مراعاتها في مركز للقناة.
- التقاط صور مضان (CCD المبردة ، Qimaging ، BC ، كندا) في مواقع مختلفة على طول القناة.
- تحليل الصور مع مضان ImageJ وOriginLab.
الشكل 1. QD - الحنق يوفر مؤشرا الحساسة من ظهور Nanocomplexes DNA التجميع الذاتي
- يمكن أن الكم نقطة بوساطة الطاقة الرنين مضان نقل (QD - الحنق) تقديم مؤشرات كمية وحساسة للغاية للاستقرار في أي من البيئات polyplex خارج أو داخل الخلوية ، مما يسمح للكشف لا لبس فيه من ظهور التفاعلات بين الحمض النووي والجينات الحاملة. وقد تم اختيار الزوج الحنق ، و605QD Cy5 ، على أساس تحقيق أقصى قدر من التداخل الطيفي بين الجهات المانحة ومتقبل وتقليل احتمال عبر الحديث. لهذا الزوج ، والمسافة هي فورستر 69.4Å 3
- التجميع الذاتي للnanocomplexes DNA - QD الحنق. وكان المسمى DNA البلازميد أنيوني (pDNA) والناقل الجينات الموجبة مع QD (الطاقة المانحة) وCy5 (الطاقة متقبل) ، على التوالي. وتم تشكيل QD - الحنق nanocomplexes تقوصر المعقدة من خلال كهرباء. على الإثارة في 488 نانومتر ، وأشار QD - الحنق بوساطة Cy5 الانبعاثات تشكيل nanocomplex المدمجة وسليمة. ويمكن حساب الوقت الإقامة (ر R) وفقا للمسافة (خ) الذي يقيس تيارات من حيث يلتقي الاثنان في موقف رد الفعل قيد التحقيق ، وسرعة تدفق يعني (V). نظرا لطبيعة التدفق الصفحي ، والخلط يستغرق سوى مكان في واجهة (وسط كل صورة) ، مما يسمح الحساب الدقيق للنقل الجماعي بوصفها وظيفة من R ر. ويمكن تعديل القرار الزماني من خلال تغيير applieد معدلات التدفق. (الشكل) الحنق بوساطة وحظ إشارة مباشرة في الواجهة عندما التقى الاثنان تيارات ، مشيرا إلى أن الربط كان سريعا ، والتي تحدث في غضون بضع ميلي ثانية وفقا لمعدلات تدفق التطبيقية. بار النطاق : 100μm.
Discussion
- الأهمية في عملنا :
- هذه هي أول محاولة لرصد البوليمرية DNA nanocomplex التجميع الذاتي حركية في الوقت الحقيقي (ملي القرار) من خلال ردود QD - الحنق داخل رقاقة ميكروفلويديك بسيطة.
- QD بوساطة الحنق يوفر مؤشرا حساسة للغاية والكمي لبدء التفاعلات الجزيئية وخلال عملية التجميع الذاتي ، في حين يقدم على microfluidics المكروية التي تسيطر عليها بشكل جيد لتحليل عملية مكانيا خلال توليف الحمض النووي nanocomplex.
- تكامل على microfluidics وnanophotonics يوحي نهج جديد ومثير للاهتمام في التحقيق في أي نوع من التفاعلات complexation.
- يمكن أن ينجم عن ذلك الحنق nanocomplexes QD - DNA البوليمرية تطبيقها بيسر لإقامة هيكل وظيفة العلاقات. 1،2
Acknowledgments
دعم التمويل المقدم من المعاهد الوطنية للصحة منح HL89764 NSF ، منح 0546012 ، 0730503 0725528 و.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 | MicroChem Corp. | SU-8 2025 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Plasmid DNA | Clontech Laboratories | pEGFP-C1 | 4.9 kb, MW = 3.3 x 106 |
| LabelIT Biotin Labeling Kit | Mirus Bio LLC | MIR 3400 | Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work. |
| Streptavidin 605QD | Invitrogen | Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate | |
| Cy5-NHS Ester | Amersham | PA15101 | |
| Chitosan | Vanson | 390 kDa | 83.5% deacetylated |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545C | No. 1; Size: 40 x 22mm |
| Gastight Glass Syringe | Hamilton Co | TLL series | 50μL to 500μL depending on sample volume |
| Tygon Tubing | Small Parts, Inc. | 0.02 ID, 100ft | Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft |
| Connector | Small Parts, Inc. | HTX-23R | Customized in length of 0.750" |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD-2000 | |
| CCD | QImaging | Intensified Retiga Cooled | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX-51 | 100W mercury arc lamp |
| ImageJ | National Institutes of Health | v1.36b | http://rsb.info.nih.gov/ij |
| Origin Pro8 | OriginLab | Student Version | |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 475AF40 | Excitation filter in both channels |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595AF60 | Emission filter in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 670DF40 | Emission filter in QD-FRET channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 500 DRLP | Long pass dichroic in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595DRLP | Long pass dichroic in QD-FRET channel |
References
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. J Control Release. 116, 83-89 (2006).
- Chen, H. H. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET. Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).
- Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H.
