Summary
Biz gelecekteki nükleik asit temelli tedaviler için daha iyi kontrol ve sentez üniforma ve özelleştirilebilir polyplexes sağlaması bekleniyor polielektrolit polyplexes oluşumunu araştırmak için yeni ve güçlü bir entegrasyon sahipliği yapacaktır (QD-FRET) ve Mikroakiskan sunuyoruz.
Abstract
Genomik gelişmeler, hücresel ve moleküler düzeyde patogenezi hedef terapötikler gelişme yakıt devam ediyor. Genelde hücre içinde fonksiyonel, nükleik asit temelli tedaviler etkili bir hücre içi dağıtım sistemi gerektirir. Bir yaygın olarak kabul edilen bir yaklaşım bozulması karşı koruyarak DNA hücresel alımını kolaylaştıran, elektrostatik kendini montaj yoluyla nanocomplexes oluşturmak için bir gen taşıyıcı ile karmaşık DNA. , Erken disosiasyon ya da çok istikrarlı bağlama hücresel alımı ve terapötik etkinliği için zararlı olabilir çünkü meydan okuma, etkin gen taşıyıcıların rasyonel tasarım yatıyor. Toplu karıştırma tarafından sentezlenen Nanocomplexes nanocomplexes büyüklüğü ve istikrar içinde heterojen atfedilen açma hücre içi ve ticareti davranış, çeşitli gösterdi. Böyle bir heterojenite, kendini montaj kinetiği doğru değerlendirme engelleyen ve onların fiziksel özellikleri transfeksiyon verimliliği veya bioactivities ilişkilendirerek zorluk ekler. Biz sahipliği yapacaktır (yani QD-FRET) ve Mikroakiskan laminer akış altında nanocomplex kendini montaj gerçek zamanlı kinetiği karakterize bir roman yakınsama sunuyoruz. Mikroakiskan yüksek temporal çözünürlük (~ milisaniye) ile mekansal sürecini analiz etmek için iyi kontrollü mikroçevresinin sunar ise, QD-FRET sentez süreci boyunca moleküler etkileşimler ve kantitatif ölçümü başlamasından son derece hassas bir göstergesi sağlar. Polimerik nanocomplexes modeli sistem için, iki ayrı self-montaj işlemi aşamalarında bu analitik platformu tarafından ele geçirildi. Microscale elde edilen öz-montaj işlemi kinetik yönü birçok mikro ve nano ölçekli uygulamalar için ilgili microreactor tabanlı reaksiyonlar için özellikle değerli olacaktır. Ayrıca, nanocomplexes microfludic cihazların uygun tasarımı sayesinde özelleştirilmiş olabilir, ve elde edilen polimerik DNA nanocomplexes yapı-işlev ilişkileri kurmak için kolayca uygulanabilir QD-FRET.
Protocol
DNA A. biyotinilasyon
Plazmid DNA kovalent olarak üretici (Mirus Bio, Madison, WI) tarafından açıklanan, ancak ~ DNA ortalama 1-2 biotin etiketler ölçekli guanin özel biotin etiketleri ile biotinlenmiş. Plazmid DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) bu protokol etiketli oldu.
- 1μg/μL DNA çözümü DNaz-özgür ve RNaz-TE tamponu (moleküler biyoloji sınıf kaliteli) suya pDNA istenilen miktarda eritilir.
- Aşağıdaki reaksiyon karışımları kullanarak etiketleme reaksiyon Davranış. BT reaktif son Etiket ekleyin.
100μg DNA reaksiyon için:
| DNaz ücretsiz ve RNaz ücretsiz su | 75 mcL |
| 10X Etiketleme Tampon A | 20 mcL |
| 1μg/μL DNA | 100 mcL |
| BT reaktif Etiket | 5 mcL |
| Toplam Hacim | 200 mcL |
- 37 ° C'de 1 saat süreyle reaksiyon inkübe edin.
- Etanol veya isopropanol yağış standart protokoller etiketli numune arındırın.
Not: Jel filtrasyon tabanlı sütun DNA sayısallaması veya floresan karakterizasyonu etkileyebilir yüksek UV absorbans veya floresan arka plan yol açabilir.
Not: biyotinilasyon düzeyi haba tabanlı testler ile belirlenebilir.
Cy5 Katyonik Polimer B. Etiketleme
Chitosan (% 83.5 deacetylated 390 kDa Vanson, Redmond, WA) bu çalışmada bir model katyonik polimer olarak kullanılmıştır. Kitosan polimer omurgasına ücretsiz olarak birincil aminler Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ile etiketlenir.
- Cy5 boya komple konjugasyon kolaylaştırmak için, Cy5 NHS gerekli miktarı hesaplamak Cy5, molar oranda böyle: 200: birincil aminler 1.
- NaOH ilavesi ile ~ 6.5 pH kitosan çözümü (25mm asetat tampon) ayarlayın. Not NHS reaksiyon bazik pH daha etkilidir, ancak burada chitosanın çözünürlük çalışma pH aralığı sınırları.
- Karıştırarak iken, yavaş yavaş bir damla bırak şekilde kitosan çözüm Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) hesaplanan miktar ekleyin.
- Gece karanlıkta, oda sıcaklığında karışımı çalkalayın.
- Arındırmak için,% 1 asetat tamponu karşı karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat süreyle 10k MWCO Slayt-a-Lyzer (Pierce) ile dialyze.
- 2 saat karanlıkta, oda sıcaklığında bir başka tampon ve dialyze değiştirin.
- Tampon ve 4 gecede dialyze ° C karanlıkta değiştirin.
- Mağaza saflaştırılmış etiketli -20 ° C'de polimer
Not: Bu çalışmada, standart bir eğri, 670 nm Cy5-NHS ester emisyon yoğunluğu ölçümü ile inşa edilmiştir . Standart eğri Cy5 etiketli kitosan 670 nm'de elde edilen emisyon ölçüm etiketleme yoğunluğu karakterize eder. Absorbans etiketleme etkinliğini belirlemek için de kullanılır olabilir ama burada değildi.
QD etiketli DNA ve Cy5-Polimer C. Hazırlık
QD için pDNA molar oranı aşan tutulur (pDNA: QD ≈ 1: 2) pDNA için QDS tam konjugasyon sağlamak. TEM görüntüleme veya eşdeğer diğer tesisleri ile her pDNA üzerine etiketli QDS sayısı tahmin edilebilir. Bizim çalışmamızda, pDNA ortalama QDS sayısı olduğu tahmin edilmektedir ~ TEM ve tek bir molekül spektroskopisi tarafından 1-3. Hazırlanması sırasında 1 Kullanım Millipore Milli-Q degrade su (0.2um süzülmüş> 18.0 MW).
- 10μg pDNA istenilen N / P oranına göre chitosanın gerekli miktarda DNA çözümü olumsuz fosfat kitosan çözüm Protonlaşmış aminlerin teorik oranını hesaplayın.
- Biotinlenmiş pDNA çözüm streptavidin Fonksiyonlu 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) ekleyin.
- 15 dakika süreyle karanlıkta, oda sıcaklığında çözüm inkübe edin.
- QD-işaretli DNA son hacmi 200μL yapmak için 50 mM sodyum sülfat çözeltisi içine ekleyin.
- Milli-Q su ile son hacim 200μL yapmak için, istenilen N / P oranı göre, Cy5-kitosan seyreltilir.
Not: mümkün photobleaching önlemek için koyu reaksiyon tutun.
Önemli: Bu katalogda Kuantum nokta FRET bir amaç için tasarlanmış Qdot 605 ITK ™ streptavidin konjuge (ITK serisi), kullanmak için dikkatli olun. Düzenli Qdot serisi özellikle hücresel etiketlenmesi için, non-spesifik bağlama önlemek için PEG tabakası ile konjuge. Ancak, bu ek kaplama r, donör-alıcı uzaklığı büyütür.enerji transfer verimliliği educed.
Standart Fotolitografi SU-8 Master D. Fabrikasyon
- Si gofret piranha ° C 'de 5 dakika süreyle temizlenmelidir ve 200 pişmiş.
- 25μm, belirlenen ana kalınlığı, spin kat 30 saniye boyunca 2000 rpm'de Si levhası üzerindeki olumsuz fotorezist (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA).
- Yumuşak fırında 65 bir rampa ile ocak gofret ° C / saat - 95 ° C
- 250mJ/cm 2 için UV ışık (365nm), mikro tasarım içeren bir maske film (CAD / Sanat Hizmetleri, Bandon, OR) yoluyla maruz .
- Maruziyet sonrası, 65 bir rampa ile bir ocak gofret fırında ° C / saat - 95 ° C
- SU-8 fotorezist geliştirici kullanarak gofret geliştirin.
- Desenli gofret sert bir rampa, 65 ocak üzerinde pişirilir ° C / saat ile 200 ° C Oda sıcaklığına kadar gofret, daha sonra yavaş yavaş serin, en az 5 saat süreyle 200 ° C'de gofret koruyun.
Önemli: süresince kademeli Ramping SU-8 ana pişirme işlemi gereklidir, aksi takdirde SU-8 yapısı silikon gofret veya çatlak kopuk SU-8 yapısı, stres sürümü ile indüklenen olabilir .
Kapak Cam ustaları ve Bağlanma PDMS E. Replica Kalıp
- SU-8 ana tartı tekne yerleştirilir.
- 10 karıştırın silikon elastomer ve kür ajanı (Poli (dimethylsiloxane), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI): 1 oranında.
- SU-8 ana PDMS karışımın üzerine dökün ve kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum desikatörde tartım tekneden ayrılabilirsiniz.
- 1-2 saat 65 ° C'de PDMS Cure.
- Si master kalıp PDMS şerit soyun.
- Punch kanal girişleri ve çıkışları akışkan cihaz.
- PDMS şerit ve etanol ile cam kapak ve hava kuru temizleyin.
- Oksijen plazma ile temizlenmelidir PDMS şerit ve cam kapak (1dk için 20W) davranın.
- Cam kapak ile hemen bağ PDMS şerit.
- 95 ° C'de gece boyunca fırında gümrüklü mikroakışkan çip bırakın.
Önemli: Plazma tedavi ve gecede pişirme gelişmiş yapıştırma gücü için gerekli.
F. Monitör mikroakışkan Aygıt DNA Nanocomplexes oluşumu
- Deney sırasında düzgün akışını sağlamak için reaktifler yüklemeden önce, mikroakışkan kanal (mikroakışkan kanal içinde herhangi bir baloncuklar olmadığından emin olmak için) su ile doldurun.
- Video açıklanan boru yoluyla, iki ayrı cam şırınga QD etiketli DNA ve Cy5 etiketli kitosan çözümleri yükleyin.
- Tüp mikroakışkan cihazlar iki girişleri ile bağlayın. Işlemi sırasında herhangi bir hava tanıtmak için dikkatli olun. Laminer akış koşulları altında, 20nL/min (PHD-2000 şırınga pompası, Holliston, MA) akış hızını ayarlayın.
- Mikroskop altında mikro kontrol edin.
- Akış stabil (~ 15 ila 20 dakika), QD-aracılı kanalın merkezi dikkat edilmelidir FRET.
- Kanal boyunca farklı yerlerde floresan resimler (Soğutmalı CCD, Qimaging, BC, Kanada) ele alalım.
- ImageJ ve OriginLab floresan görüntüleri analiz.
Şekil 1. QD-FRET DNA Nanocomplexes self-montaj başlangıç hassas bir gösterge sağlar
- Kuantum nokta-aracılı floresan rezonans enerji transferi (QD FRET) net tespiti için DNA ve gen taşıyıcı arasındaki etkileşimleri başlangıç sağlayan, ekstra ya da hücre içi ortamlarda ya polyplex istikrar nicel ve çok hassas bir göstergesi sağlayabilir. FRET çifti, 605QD ve Cy5, donör ve alıcı arasındaki spektral örtüşme maksimize etmek ve potansiyel çapraz konuşma minimize dayalı seçildi. Bu çifti için, Förster mesafe 69.4Å 3
- Self-assembly QD-FRET DNA nanocomplexes. Anyonik plazmid DNA (pDNA) ve katyonik gen taşıyıcı, sırasıyla QD (enerji donör) ve Cy5 (enerji alıcı) ile işaretlenmiştir. QD-FRET nanocomplexes elektrostatik karmaşık Koaservasyon yoluyla oluşmuştur. QD-FRET aracılı Cy5 emisyon 488 nm uyarma üzerine, kompakt ve sağlam nanocomplex oluşumu göstermiştir. Kalma süresi (t R) iki dere soruşturma altında reaksiyon konumu ve ortalama akış hızı (v) buluştuğu önlemler mesafe (x) göre hesaplanabilir. Karıştırma, laminer akış doğası nedeniyle sadece hassas hesaplama t R fonksiyonu olarak toplu taşıma izin arayüzü (her görüntünün merkezi) yer alır. Zamansal çözünürlük applie değiştirerek ayarlanabilird akış oranları. (Ankastre) FRET-aracılı sinyal uygulanan akış hızlarına göre birkaç milisaniye içinde meydana gelen bu bağlama hızlı olduğunu belirten, iki dere bir araya geldi arayüzü hemen gözlendi. Ölçek Bar: 100μm.
Discussion
- Yaptığımız işin önemi:
- Bu basit bir mikroakışkan çipi içinde QD-FRET yanıtları aracılığıyla gerçek zamanlı olarak polimerik DNA nanocomplex kendini montaj kinetiği (milisaniye çözünürlük) izlemek için ilk girişimi.
- Mikroakiskan mekansal, DNA nanocomplex sentezi sırasında sürecini analiz etmek için iyi kontrollü mikroçevresinin sunuyor ise QD-aracılı FRET, moleküler etkileşimlerin başlangıcı ve self-montaj süreci boyunca son derece duyarlı ve kantitatif bir gösterge sağlar.
- Mikroakiskan ve sahipliği yapacaktır entegrasyonu kompleks reaksiyonlar her türlü araştırmak için yeni ve ilginç bir yaklaşım göstermektedir.
- Çıkan QD-FRET polimerik DNA nanocomplexes yapı-işlev ilişkileri kurmak için kolayca uygulanabilir. 1,2
Acknowledgments
NIH hibe HL89764, NSF hibe 0.546.012, 0.730.503 ve 0.725.528 tarafından sağlanan fon desteği.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 | MicroChem Corp. | SU-8 2025 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Plasmid DNA | Clontech Laboratories | pEGFP-C1 | 4.9 kb, MW = 3.3 x 106 |
| LabelIT Biotin Labeling Kit | Mirus Bio LLC | MIR 3400 | Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work. |
| Streptavidin 605QD | Invitrogen | Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate | |
| Cy5-NHS Ester | Amersham | PA15101 | |
| Chitosan | Vanson | 390 kDa | 83.5% deacetylated |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545C | No. 1; Size: 40 x 22mm |
| Gastight Glass Syringe | Hamilton Co | TLL series | 50μL to 500μL depending on sample volume |
| Tygon Tubing | Small Parts, Inc. | 0.02 ID, 100ft | Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft |
| Connector | Small Parts, Inc. | HTX-23R | Customized in length of 0.750" |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD-2000 | |
| CCD | QImaging | Intensified Retiga Cooled | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX-51 | 100W mercury arc lamp |
| ImageJ | National Institutes of Health | v1.36b | http://rsb.info.nih.gov/ij |
| Origin Pro8 | OriginLab | Student Version | |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 475AF40 | Excitation filter in both channels |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595AF60 | Emission filter in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 670DF40 | Emission filter in QD-FRET channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 500 DRLP | Long pass dichroic in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595DRLP | Long pass dichroic in QD-FRET channel |
References
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. J Control Release. 116, 83-89 (2006).
- Chen, H. H. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET. Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).
- Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H.
