Summary
우리는 미래의 핵산 기반 치료제를위한 균일한 및 사용자 정의 polyplexes보다 제어하고 합성을 제공하는 것으로 예상된다 고분자 전해질의 polyplexes의 형성을 조사하기 위해 nanophotonics (QD - 걱정)와 microfluidics의 소설과 강력한 통합을 제시한다.
Abstract
유전체학의 발전은 세포 및 분자 수준에서 pathogenesis를 타겟팅할 수 있습니다 치료제의 개발을 연료로 진행합니다. 세포 내부의 일반적 기능, 핵산 기반 치료제는 효율적인 세포 전달 시스템이 필요합니다. 하나는 널리 채택 방법은 저하에 대해 그것을 보호하면서 DNA의 세포 이해를 촉진, 자기 조립 정전기를 통해 nanocomplexes를 형성하는 유전자 캐리어와 복잡한 DNA 것입니다. 조기 분리하거나 지나치게 안정 바인딩 세포 이해와 치료 효능에 해로운 것입니다 때문에 과제는 효율적인 유전자 사업자의 합리적인 설계에 자리잡고 있습니다. 대량 혼합하여 합성 Nanocomplexes는 nanocomplexes의 크기와 안정성에 이질에 기인했다 풀고 세포와 인신 매매 행위의 다양한을 보여주었다. 이러한 이질은 자기 조립 속도론의 정확한 평가를 방해하고 transfection 효율성이나 bioactivities 자신의 물리적 속성을 연관의 어려움으로 추가합니다. 우리는 층류에서 nanocomplex 자기 조립의 실시간 속도론을 특성화 nanophotonics (즉, QD - 걱정)와 microfluidics의 소설 컨버전스를 제시한다. microfluidics가 높은 시간적 공간 해상도 (~ 밀리초)와 프로세스를 분석 잘 제어 microenvironment를 제공하는 반면 QD - 걱정은 합성 과정에서 분자 상호 작용 및 정량 측정의 발병의 매우 민감한 표시를 제공합니다. 고분자 nanocomplexes의 모델 시스템의 자기 조립 과정에서 별개의 두 단계는이 분석 플랫폼에 의해 점령되었다. microscale에서 얻은 자기 조립 공정의 운동 양상은 많은 마이크로 및 나노 스케일 응용 프로그램에 관련된 microreactor 기반 반응에 특히 도움이 될 것입니다. 또한, nanocomplexes는 microfludic 장치의 적절한 설계를 통해 사용자 정의할 수 있으며, 결과 고분자 DNA를 nanocomplexes가 쉽게 구조 - 기능 관계를 설립 적용 될 수 QD는 - 무서워.
Protocol
DNA의 A. Biotinylation
플라스미드 DNA는 covalently으로 제조 업체 (Mirus 바이오, 매디슨, WI)에 의해 설명하지만, DNA 당 ~ 1-2 비오틴 라벨을 가지고 스케일 구아닌 특정 비오틴의 레이블 biotinylated되었습니다. 플라스미드 DNA (pEGFP - C1, 4.9 킬로바이트, Clontech, 마운틴 뷰, CA)는이 프로토콜의 표시되었습니다.
- 1μg/μL DNA 솔루션을 만들기 위해 DNase - 무료 RNase - 무료 TE 버퍼 (분자 생물학 수준의 품질) 물에 pDNA의 원하는 금액을 디졸브.
- 다음 반응 혼합물을 사용하여 라벨 반응을 실시합니다. IT는 시약 마지막으로 레이블을 추가합니다.
100μg DNA 반응의 경우 :
| DNase - 무료 및 RNase없는 물 | 75 μL |
| 10X 라벨링 버퍼 | 20 μL |
| 1μg/μL DNA | 100 μL |
| IT에게 시약 레이블을 | 5 μL |
| 총 볼륨 | 200 μL |
- 37 반응 ° C 1 시간을 품어.
- 표준 프로토콜 다음 에탄올 또는 이소프로판올 강수에 의해 표시된 샘플을 정화.
참고 : 젤 여과 기반 열 DNA를 부량 또는 형광 특성에 영향을 미칠 수있는 높은 자외선 흡광도 또는 형광 배경에 발생할 수 있습니다.
참고 : biotinylation의 수준이 하바 기반 테스트에 의해 결정 수 있습니다.
Cy5 - 양이온 폴리머의 B. 라벨링
키토산은 (83.5 % deacetylated 390 KDA, 밴슨, 레드 몬드, WA) 본 연구에서는 모델 양이온 폴리머로 사용되었다. 키토산 고분자 백본에 무료로 기본 아민은 Cy5 - NHS (애머스햄 Biosciences, 피스 카타 웨이, 뉴저지)로 분류되었습니다.
- Cy5 염료의 완벽한 활용을 촉진하기 위하여, Cy5 - NHS의 필요한 양을 계산 Cy5의 어금니 비율 그러한 : 200 : 기본 아민은 1입니다.
- NaOH를 추가로 ~ 6.5에 키토산 솔루션의 산도를 (25mM 아세테이트 버퍼)을 조정합니다. NHS 반응 기본 산도에 더 효율적이지만, 여기에 키토산의 용해도가 작동 산도 범위를 제한합니다.
- 감동 동안 천천히 드롭하여 드롭 방식으로 키토산 솔루션에 Cy5 - NHS (1 MG / ML DMSO)의 계산된 금액을 추가합니다.
- 하룻밤 상온에서 어둠의 혼합물을 선동하다.
- 정화, 어둠의 온도는 실온에서 1 % 아세테이트 버퍼에 대해 2 시간에 대한 10K MWCO 슬라이드 - A - Lyzer (피어스)와 dialyze.
- 어둠 속에서 적당한 온도로 또 다른 2 시간을 버퍼와 dialyze 바꿉니다.
- 버퍼와 4 박 dialyze ° 어둠 C를 교체하십시오.
- 스토어 정화는 -20 ° C.에 폴리머를 표시
참고 :이 연구에서는 표준 곡선은 670 nm의에서 Cy5 - NHS 에스테르의 방출 강도를 측정하여 구성되어 있습니다. 표준 곡선 Cy5 - 표시 키토산에서 670 nm의에서 얻은 방출을 측정하여 라벨 밀도를 특징. 흡광도는 또한 상표의 효율을 결정하는 데 사용될 수 있으나 여기에 수행되지 않았습니다.
QD - 라벨 DNA와 Cy5 - 폴리머의 C. 준비
QD에 pDNA의 어금니 비율을 초과 보관 (pDNA : QD ≈ 1 : 2)되었습니다 pDNA에 QDs의 완전한 활용을 보장합니다. 각 pDNA에 표시 QDs의 숫자는 TEM 이미지 또는 기타 이에 상응하는 시설을 통해 추측하실 수 있습니다. 우리의 연구에서 pDNA 당 QDs의 개수가 될것으로 예상되는 ~ TEM와 단일 분자 분광학에 의해 1-3. 준비 중 하나를 사용 Millipore 밀리 Q 그라데이션 물 (0.2um는 필터링> 18.0 MW).
- 원하는 N / P 비율에 따라 10μg pDNA에 대한 키토산의 필요한 금액 DNA 솔루션의 부정 인산염에 대한 키토산의 솔루션에 protonated 아민의 이론적인 비율을 계산합니다.
- biotinylated pDNA 솔루션에 streptavidin - 기능화 605QDs을 (Qdot 605 ITK, Invitrogen, 칼스 배드, CA) 추가합니다.
- 15 분 동안 짙은 어둠 속에서 실온에서 솔루션을 품어.
- 최종 볼륨 200μL를 50 MM 나트륨 황산 용액에 QD - 라벨 DNA을 추가합니다.
- 최종 볼륨 200μL를 만들기 위해 밀리 Q 물로, 원하는 N / P 비율에 따라, Cy5 - 키토산을 희석.
참고 : 가능한 photobleaching을 방지하기 위해 어둠 속에서 반응을 유지.
중요 :이 카탈로그에 양자 점들은 걱정의 목적을 위해 설계되었습니다과 같은 Qdot 605 ITK ™ streptavidin 공액 (ITK 시리즈)를 사용하여주의하십시오. 일반 Qdot 시리즈는 특히 세포 라벨을위한이 아닌 특정 바인딩을 방지하기 위해 PEG 레이어와 복합 수 있습니다. 그러나,이 추가적인 코팅 R의 결과, 기증자 - 수용체의 거리를 enlarges에너지 전송 효율을 educed.
표준 석판술을 사용하여 SU - 8 마스터스의 D. 제작
- 시 웨이퍼는 피라 냐는 물고 기지 너한테 ° C 5 분 청소하고 200 구운 것입니다.
- 25μm의 지정된 마스터 두께, 스핀 코트 30 초 2000 RPM에서시 웨이퍼에 부정적인 포토 레지스트 (SU - 8 2025, Microchem, 뉴턴, MA)의 경우.
- 소프트 베이킹 65 램프와 열판에 웨이퍼 ° 95 C / HR ° C.
- microchannels의 디자인을 포함하는 마스크 필름 (CAD / 아트 서비스, 밴든, OR)를 통해 250mJ/cm 2 자외선 (365nm)에 노출.
- 포스트 - 노출 65 램프와 열판에 웨이퍼를 구워 ° 95 C / HR ° C.
- SU - 8 포토 레지스트 개발을 사용하여 웨이퍼를 개발.
- 패턴 웨이퍼는 하드 65 램프와 열판에 구운 있습니다 ° 200 C / HR ° C. 실내 온도로 웨이퍼 후 서서히 냉각, 최소한 5 시간 동안 200 ° C에서 웨이퍼를 유지합니다.
중요 : 동안 서서히 올렸 SU - 8 마스터 베이킹 과정이 필요하며, 그렇지 않으면 SU - 8 구조에서 실리콘 웨이퍼 또는 균열에서 분리된 수있는 SU - 8 구조가 스트레스에 의해 유발 공개 수 있습니다.
주인과 본딩의 커버 유리에 PDMS의 E. 복제 성형
- SU - 8 마스터는 무게 보트에 배치됩니다.
- 10 믹스 실리콘 엘라스토머 및 치료 에이전트 (폴리 (dimethylsiloxane), PDMS, Sylgard 184, 다우 코닝, 미들랜드, MI) : 1의 비율.
- SU - 8 마스터에 PDMS 혼합물을 붓고하고 거품을 제거하는 진공 건조기의 무게 보트를 두십시오.
- 1-2시간 65 ° C에서 PDMS 치료.
- 시 마스터 금형에서 PDMS 스트립 껍질.
- 펀치 채널 인레츠 및 유체 장치의 매장.
- 다음 PDMS 스트립과 커버 유리 에탄올과 공기 건조를 청소합니다.
- 산소 플라즈마와 함께 청소 PDMS 스트립과 커버 유리 (1min위한 20W) 취급.
- 커버 유리 즉시 결합 PDMS 스트립.
- 95 ° C에서 하룻밤을 위해 오븐에 보세 microfluidic 칩을를 남겨주세요.
중요 : 플라즈마 치료 및 야간 제빵가 향상된 접합 강도에 필수적입니다.
F. 모니터 Microfluidic 장치의 DNA Nanocomplexes 형성
- 실험 기간 동안 원활한 흐름을 보장하기 위해 시약을 로딩하기 전에 물을 microfluidic 채널 (microfluidic 채널 이내에 거품이 없다는 확인)를 입력합니다.
- 비디오에 설명되어있는 튜브를 통해 두 개의 개별적인 유리 주사기로 QD - 라벨 DNA와 Cy5 - 라벨 키토산 솔루션을로드합니다.
- microfluidic 장치의 두 인레츠과 튜빙을 연결합니다. 프로세스를 진행하는 동안 공기를 도입하지 않기로주의하십시오. 층류 흐름 조건 하에서 20nL/min (PHD - 2000 주사기 펌프, 홀리스튼, MA)에서 흐름 속도를 설정합니다.
- 현미경 microchannels를 확인합니다.
- 흐름이 (~ 15-20분) 안정되면, QD - 중재은 채널의 중심에서 관찰되어야 무서워.
- 채널 따라 다른 위치에서 형광 사진 (냉각 CCD, Qimaging, BC, 캐나다) 가져가라.
- ImageJ 및 OriginLab과 형광 이미지를 분석합니다.
그림 1. QD - 안달이 DNA의 Nanocomplexes 자기 조립의 시작의 중요한 표시를 제공합니다
- 양자 도트 중재 형광 공명 에너지 전달 (QD - 프렛)은 DNA와 유전자 항공사 간의 상호 작용의 발병을 모호하지 감지 수 있도록 추가 또는 내부 세포 환경 중 하나에서 polyplex 안정성의 양적 고도 민감한 표시를 제공할 수 있습니다. 안달 쌍, 605QD와 Cy5는 기증자와 수용체 사이의 스펙트럼 중복을 극대화하고 잠재적인 상호 대화를 최소화 기반으로 선정되었습니다. 이 쌍이 들어, 포스터 거리가 69.4Å 있습니다 3.
- QD - 프렛의 DNA nanocomplexes의 자기 조립. 음이온 플라스미드 DNA (pDNA)과 양이온 유전자 캐리어는 각각 QD (에너지 기증자)와 Cy5 (에너지 수용체)로 분류되었습니다. QD - 안달 nanocomplexes은 정전 복잡한 coacervation을 통해 형성되었습니다. 488 nm의 여기에시, QD - 무서워 - 중재 Cy5 방출은 콤팩트하고 그대로 nanocomplex 형성을 지적했다. 체류 시간은 (T R) 두 스트림 조사에 따라 반응의 위치와 의미 흐름 속도 (V)을 충족 어디에서 측정 거리 (X)에 따라 계산하실 수 있습니다. 혼합, 층류의 특성으로 인해은 T R의 함수로 대량 운송의 정확한 계산을 수 있도록 인터페이스 (각 이미지의 중심)에서 이루어집니다. 시간적 해상도가 applie을 변화하여 조정할 수 있습니다D 흐름 속도. (삽입된 페이지) 무서워 - 중재 신호가 적용 유량에 따라 몇 밀리초 내에 발생, 그 바인딩이 빠른했습니다 나타내는 두 시냇물가 만난 인터페이스 즉시 관찰되었다. 스케일 바 : 100μm.
Discussion
- 우리 연구의 의의 :
- 이것은 간단한 microfluidic 칩을 이내 QD - 안달 응답을 통해 실시간으로 고분자의 DNA nanocomplex 자기 조립 속도론 (밀리초 해상도)를 모니터링하는 최초의 시도이다.
- microfluidics은 공간의 DNA nanocomplex 합성하는 동안 프로세스를 분석 잘 제어 microenvironment를 제공하는 반면 QD - 중재 걱정은 분자 상호 작용의 발병과 자기 조립 공정 전반에 걸쳐 매우 민감하고 정량적 표시를 제공합니다.
- microfluidics과 nanophotonics의 통합 complexation 반응의 종류를 조사하기 위해 새로운 흥미로운 접근 방식을 제안합니다.
- 결과 QD - 안달 고분자의 DNA nanocomplexes는 즉시 구조 - 기능 관계를 설립 적용 수 있습니다. 1,2는
Acknowledgments
NIH 그랜트 HL89764, NSF 교부금 0,546,012, 0,730,503 및 0,725,528에 의해 제공된 자금 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 | MicroChem Corp. | SU-8 2025 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Plasmid DNA | Clontech Laboratories | pEGFP-C1 | 4.9 kb, MW = 3.3 x 106 |
| LabelIT Biotin Labeling Kit | Mirus Bio LLC | MIR 3400 | Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work. |
| Streptavidin 605QD | Invitrogen | Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate | |
| Cy5-NHS Ester | Amersham | PA15101 | |
| Chitosan | Vanson | 390 kDa | 83.5% deacetylated |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545C | No. 1; Size: 40 x 22mm |
| Gastight Glass Syringe | Hamilton Co | TLL series | 50μL to 500μL depending on sample volume |
| Tygon Tubing | Small Parts, Inc. | 0.02 ID, 100ft | Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft |
| Connector | Small Parts, Inc. | HTX-23R | Customized in length of 0.750" |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD-2000 | |
| CCD | QImaging | Intensified Retiga Cooled | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX-51 | 100W mercury arc lamp |
| ImageJ | National Institutes of Health | v1.36b | http://rsb.info.nih.gov/ij |
| Origin Pro8 | OriginLab | Student Version | |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 475AF40 | Excitation filter in both channels |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595AF60 | Emission filter in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 670DF40 | Emission filter in QD-FRET channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 500 DRLP | Long pass dichroic in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595DRLP | Long pass dichroic in QD-FRET channel |
References
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. J Control Release. 116, 83-89 (2006).
- Chen, H. H. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET. Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).
- Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H.
