Kombinera QD-bandet och Mikrofluidik till Monitor DNA Nanocomplex självorganisering i realtid

Summary

Vi presenterar en ny och kraftfull integration av nanofotonik (QD-FRET) och mikrofluidik att undersöka bildandet av polyelektrolyt polyplexes, vilket förväntas ge bättre kontroll och syntes av enhetliga och anpassningsbara polyplexes för framtida nukleinsyra-baserade läkemedel.

Abstract

Framsteg inom genomik fortsätta att leda till att utvecklingen av läkemedel som kan rikta patogenes på cellulär och molekylär nivå. Vanligtvis funktionella inuti cellen, nukleinsyra-baserade läkemedel kräver ett effektivt intracellulär leveranssystem. Ett allmänt antagits sätt är att komplexa DNA med en gen som bärare för att bilda nanocomplexes via elektrostatisk självorganisering, underlätta cellulärt upptag av DNA samtidigt skydda den mot nedbrytning. Utmaningen ligger i rationell design av effektiva gen bärare, eftersom tidig dissociation eller alltför stabil bindande skulle vara till skada för cellulära upptag och terapeutisk effekt. Nanocomplexes syntetiseras genom bulk blanda visade ett varierat utbud av intracellulära uppackning och människohandel beteende, vilket tillskrevs den heterogenitet i storlek och stabilitet nanocomplexes. Sådana heterogenitet hindrar korrekt bedömning av självorganisering kinetik och bidrar till svårigheten att korrelera deras fysiska egenskaper för att transfektion effektivitet eller bioactivities. Vi presenterar en ny konvergens av nanofotonik (dvs. QD-FRET) och mikrofluidik att karakterisera i realtid kinetik nanocomplex självorganisering i laminärt flöde. QD-FRET ger en mycket känslig indikation på uppkomsten av molekylära interaktioner och kvantitativa mått i hela syntetisk process, medan mikrofluidik erbjuder en väl kontrollerad mikromiljö att rumsligt analysera processen med hög tidsupplösning (~ millisekunder). För modellsystem av polymera nanocomplexes har två olika stadier i självorganiserande processen fångas av denna analytisk plattform. Den kinetiska aspekten av självorganisering, erhållna vid mikroskala skulle vara särskilt värdefull för mikroreaktorer-baserade reaktioner som är relevanta för många mikro-och nano-skala. Dessutom kan nanocomplexes anpassas genom rätt utformning av microfludic enheter, och den resulterande QD-FRET polymera DNA nanocomplexes lätt skulle kunna tillämpas för att fastställa struktur-funktionssamband.

Protocol

A. Biotinylation av DNA

Plasmid-DNA var kovalent biotinylerad med guanin-specifika biotin etiketter som beskrivs av tillverkaren (Mirus Bio, Madison, WI) men skalas ha ~ 1-2 biotin etiketter per DNA. Plasmid-DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) var märkt i detta protokoll.

1. Lös upp önskad mängd av pDNA till TE buffert av DNas-fria och RNase-fria (molekylärbiologi-grade kvalitet) vatten till en 1μg/μL DNA-lösning.
2. Genomför märkningsreaktionen med följande reaktion blandningar. Lägg till Label IT-reagens sist.

För 100μg DNA reaktion:

DNas-fria och RNase-fritt vatten	75 mikroliter
10X Märkning Buffert A	20 mikroliter
1μg/μL DNA	100 mikroliter
Etikett IT-reagens	5 mikroliter
Total volym	200 mikroliter

3. Inkubera reaktionen vid 37 ° C i 1 timme.
4. Rena märkt provet genom etanol eller isopropanol nederbörd följande standardprotokoll.

Obs: gelfiltrering baserat kolumner kan leda till hög UV-absorbans eller fluorescens bakgrund, som kan påverka DNA-kvantifiering eller fluorescens karakterisering.
OBS: Nivån på biotinylation kan fastställas genom HABA-baserade tester.

B. Märkning av Cy5-katjonisk polymer

Chitosan (390 kDa, 83,5% avacetylerats, Vanson, Redmond, WA) användes som modell katjonisk polymer i denna studie. Den fria primära aminer på chitosan polymeren ryggraden var märkta med Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

1. För att underlätta komplett konjugering av Cy5 färgämne, beräkna erforderlig mängd Cy5-NHS så att molförhållandet mellan Cy5: primära aminer är 1: 200.
2. Justera pH chitosan lösning (i 25mm acetatbuffert) till ~ 6,5 genom tillsats av NaOH. Observera att NHS reaktionen är mer effektiv på grundläggande pH, men lösligheten av chitosan här begränsar arbetstiden pH-område.
3. Under omrörning, långsamt lägga den beräknade mängden Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) till chitosan lösning i en drop-by-drop sätt.
4. Skaka blandningen i mörker vid rumstemperatur över natten.
5. Att rena, dialyze med 10k MWCO Slide-a-analysatorn (Pierce) för 2 tim jämfört med 1% acetatbuffert vid rumstemperatur i mörker.
6. Byt buffert och dialyze ytterligare 2 tim vid rumstemp i mörkret.
7. Byt buffert och dialyze över natten vid 4 ° C i mörker.
8. Förvara renas märkt polymer vid -20 ° C.

OBS: I denna studie är en standardkurva konstruerad genom att mäta utsläpp intensitet Cy5-NHS-ester vid 670 nm. Karakterisera märkning densitet genom att mäta den erhållna utsläppen vid 670 nm från Cy5 märkt chitosan i standardkurvan. Absorbans kan också användas för att bestämma märkning effektivitet, men har inte genomförts här.

C. Beredning av QD märkt DNA och Cy5-Polymer

Molförhållandet mellan pDNA till QD hölls i större antal (pDNA: QD ≈ 1: 2) för att säkerställa fullständig konjugering av QDs till pDNA. Antalet QDs märkt på varje pDNA kan uppskattas genom TEM avbildning eller andra motsvarande anläggningar. I vår studie är antalet QDs per pDNA beräknas vara ~ 1-3 av TEM och enda molekyl spektroskopi. ¹ Använd Millipore Milli-Q gradient vatten (> 18,0 MW, 0.2um filtreras) under förberedelserna.

1. Beräkna önskad mängd chitosan för 10 mikrogram pDNA enligt önskad N / P-kvoten, den teoretiska förhållandet protonerade aminer i Chitosan lösning på negativa fosfater i DNA lösningen.
2. Lägg streptavidin-functionalized 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) i biotinylerad pDNA lösningen.
3. Inkubera i rumstemperatur i mörker i 15 min.
4. Lägg till QD-märkt DNA i 50 mM natriumsulfat lösning för att göra det slutliga volymen 200μL.
5. Späd Cy5-Chitosan, enligt önskad N / P-kvot, med Milli-Q vatten så att den slutliga volymen 200μL.

Anmärkning: Behåll reaktion i mörkret för att förhindra eventuella fotoblekning.
Viktigt: Var försiktig med att använda Qdot 605 ITK ™ streptavidin konjugat (i ITK-serien), som kvantprickar i denna katalog är utformade för att bandet. De regelbundna Qdot serien är konjugerat med en PEG lager för att förhindra att icke-specifik bindning, särskilt för cellulära märkning. Däremot utvidgas detta ytterligare beläggning donatorn-acceptanten avstånd, vilket ger reduced effektiv energiöverföring.

D. Tillverkning av SU-8 Masters Använda Standard Fotolitografi

1. Si wafer är piraya rengöras och bakas i 200 ° C i 5 min.
2. För den utsedda mästare tjocklek 25μm, snurra päls de negativa fotoresist (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA) på Si wafer vid 2000 rpm i 30 sek.
3. Mjuk baka rånet på en värmeplatta med en ramp på 65 ° C / timme till 95 ° C.
4. Utsättas för UV-ljus (365nm) för 250mJ/cm ² genom en mask film (CAD / Konst Tjänster, Bandon, OR) som innehåller utformningen av mikrokanaler.
5. Efter exponering grädda brödet på en värmeplatta med en ramp på 65 ° C / timme till 95 ° C.
6. Utveckla wafer med SU-8 fotoresist utvecklare.
7. Den mönstrade wafer är svårt bakas på en värmeplatta med en ramp på 65 ° C / timme till 200 ° C. Bibehåll rånet vid 200 ° C i minst 5 timmar, sedan gradvis kyler rånet ner till rumstemperatur.

Viktigt: Gradvis ramp under SU-8 mästare bakningen är nödvändig, annars SU-åtta struktur kan avlägsnas från kiselskiva eller sprickor på SU-8 konstruktion kan orsakas av stress-release.

E. Replica gjutning av PDMS av befälhavarna och tätningsmedel till täckglaset

1. SU-8 mästare placeras i en vägning båt.
2. Blanda silikon elastomer och härdare (Poly (dimetylsiloxan), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) i en 10: 1 ratio.
3. Häll PDMS blandningen på SU-8 master och lämna väger båten i en vakuumexsickator att ta bort bubblor.
4. Bota PDMS vid 65 ° C i 1-2 timmar.
5. Skala PDMS remsan från Si mästare mögel.
6. Punch-kanal inlopp och utlopp av fluidic enhet.
7. Rengör PDMS band och skyddsglas med etanol och sedan lufttorka.
8. Behandla den rengjorda PDMS band och skyddsglas med syre plasma (20W under 1 min).
9. Omedelbart binda PDMS band med skyddsglas.
10. Lämna bundna mikroflödessystem chip i ugnen på 95 ° C över natten.

Viktigt: Plasma behandling och övernattning bakning är avgörande för ökad bindning styrka.

F. Övervaka bildandet av DNA Nanocomplexes I mikroflödessystem enhet

1. Fyll mikroflödessystem kanal med vatten (för att säkerställa det inte finns några bubblor i mikroflödessystem kanal), innan du lägger reagens för att säkerställa obehindrat under experimentet.
2. Ladda QD-märkta DNA och Cy5-märkt chitosan lösningar i två enskilda glassprutor genom slangen som beskrivs i videon.
3. Anslut slangen med två vikar av mikroflödessystem enheter. Var försiktig med att inte införa någon luft under processen. Ställ in flödet på 20nL/min (PHD-2000 sprutpump, Holliston, MA), under förhållanden laminärt flöde.
4. Kontrollera mikrokanaler under mikroskop.
5. När flödet är stabilt (~ 15 till 20 minuter), QD-medierad FRET bör observeras i mitten av kanalen.
6. Ta fluorescens bilder (kyld CCD, Qimaging, BC, Kanada) på olika platser längs kanalen.
7. Analysera fluorescens bilder med ImageJ och OriginLab.

Figur 1. QD-FRET ger en känslig indikation på uppkomsten av DNA Nanocomplexes självmontering

1. Quantum dot-medierad fluorescens resonans energi överföring (QD-FRET) kan ge en kvantitativ och mycket känslig indikation Polyplex stabilitet i antingen utanför eller intracellulär miljöer, vilket möjliggör entydig detektion av uppkomsten av interaktioner mellan DNA och genen bärare. Den FRET par, 605QD och Cy5, valdes bygger på att maximera spektral överlappning mellan givaren och acceptanten och minimera potentiella cross-talk. För detta par är Förster avståndet 69.4Å ^3.
2. Självorganisering av QD-FRET DNA nanocomplexes. Anjoniska plasmid-DNA (pDNA) och katjoniska genen bärare var märkta med QD (energi donator) och Cy5 (energi acceptanten), respektive. QD-FRET nanocomplexes bildades genom elektrostatisk komplex coacervation. Vid excitation vid 488 nm, visade QD-FRET-medierad Cy5 utsläpp bildandet av en kompakt och intakt nanocomplex. Residenset tid (t _R) kan beräknas utifrån avståndet (x) som mäter från där två strömmar möts för att situationen för reaktionen under utredning, och den genomsnittliga strömningshastigheten (v). På grund av karaktären av laminärt flöde, blandning sker endast i gränssnittet (mitten av varje bild), som möjliggör exakt beräkning av masstransport som en funktion av t _R. Tidsupplösning kan justeras genom att variera gälld flöden. (Infälld) FRET-medierad signal observerades direkt i gränssnittet när de två strömmar möttes, vilket indikerar att bindande var snabb, inträffar inom några millisekunder enligt den tillämpade flöden. Skala Bar: 100μm.

Discussion

• Betydelsen av vårt arbete:
  1. Detta är det första försöket att övervaka polymera DNA nanocomplex självorganisering kinetik i realtid (millisekund upplösning) genom QD-FRET svar inom en enkel mikroflödessystem chip.
  2. QD-medierad FRET ger en mycket känslig och kvantitativ beskrivning av uppkomsten av molekylära interaktioner och hela självorganisering processen, medan mikrofluidik erbjuder en väl kontrollerad mikromiljö att rumsligt analysera processen under DNA-nanocomplex syntesen.
  3. Integrationen av mikrofluidik och nanofotonik föreslår ett nytt och intressant sätt att utreda alla typer av komplexbildning reaktioner.
  4. Den resulterande QD-FRET polymera DNA nanocomplexes kan lätt användas för att fastställa struktur-funktionssamband. ^1,2

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU-8	MicroChem Corp.	SU-8 2025
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Plasmid DNA	Clontech Laboratories	pEGFP-C1	4.9 kb, MW = 3.3 x 106
LabelIT Biotin Labeling Kit	Mirus Bio LLC	MIR 3400	Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work.
Streptavidin 605QD	Invitrogen	Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate
Cy5-NHS Ester	Amersham	PA15101
Chitosan	Vanson	390 kDa	83.5% deacetylated
Cover Glass	Fisher Scientific	12-545C	No. 1; Size: 40 x 22mm
Gastight Glass Syringe	Hamilton Co	TLL series	50μL to 500μL depending on sample volume
Tygon Tubing	Small Parts, Inc.	0.02 ID, 100ft	Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft
Connector	Small Parts, Inc.	HTX-23R	Customized in length of 0.750"
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD-2000
CCD	QImaging	Intensified Retiga Cooled
Microscope	Olympus Corporation	BX-51	100W mercury arc lamp
ImageJ	National Institutes of Health	v1.36b	http://rsb.info.nih.gov/ij
Origin Pro8	OriginLab	Student Version
Microscope Filter sets	Omega Optical	475AF40	Excitation filter in both channels
Microscope Filter sets	Omega Optical	595AF60	Emission filter in 605QD channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	670DF40	Emission filter in QD-FRET channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	500 DRLP	Long pass dichroic in 605QD channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	595DRLP	Long pass dichroic in QD-FRET channel