Summary
在这篇文章中，我们描述了我们如何取得的FRET从单个DNA分子固定到表面，使用自动扫描共聚焦显微镜的痕迹。
Abstract
荧光共振能量转移（FRET）显微镜被广泛用于研究的结构和动态，如核酸和蛋白质的分子生物的兴趣。单分子FRET（SM - FRET）测量固定分子允许长期观测系统有效，直到两种染料的光漂白时间的痕迹，从而对生物分子的动力学报告，同一个毫秒时间尺度的广泛到几分钟。为了便于收购的大量统计分析的痕迹，必须是自动化的过程，应严格控制在整个测量时间（〜12小时）和样品的环境。这是通过使用自动扫描共聚焦显微镜，让成千上万的单个分子的审讯在一夜之间，一个微细胞，允许控制的缓冲区交换，有限制的氧含量和整个测量期间保持一个恒定的温度。在这里，我们展示了如何组装的微流体装置，以及如何激活其表面DNA的固定。然后，我们解释了如何准备一个缓冲区，以便最大限度的耐光性和荧光团的寿命。最后，我们所涉及的步骤在准备设置为自动获取时间分辨的单分子FRET DNA分子的痕迹。
Protocol
1 - 组装微流体细胞
微流体细胞是通过融合作出了图案，2毫米厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）磁盘新鲜清洁的石英盖玻片。 PDMS的磁盘包含四个30μL，入口和灵活的毛细血管连接到一个缓冲区水库和注射泵，分别为控制流量的缓冲区，出口访问的矩形商会。支持流通池玻璃窗的背面，并放在一个特制的细胞含有水冷却热电元素来调节温度的持有人。
- 为了使图案的PDMS磁盘，10个部分的有机硅弹性体基地与第1部分的固化剂混合，拌匀，并离开1小时在真空脱气。
- 轻轻倒入到微细胞模具的弹性体组合。在我们的例子中，这是1负型光刻胶的4条（1 × 4 × 1 × 3 × 300微米）的硅晶片。离开这个治愈一个热点板块在70 ° C为两个小时。
- 小心剥离固化后的PDMS使用刀片模具磁盘。融合到一个1英寸的玻璃窗口等离子的氧化两面为30秒（含8 x 2毫米直径预钻孔在通道的两端）的磁盘。保险丝上的PDMS盘平面一侧的车窗玻璃（不包含渠道方）。
- 通过每一个玻璃窗口的孔中插入一个2英寸长的灵活熔融石英毛细管，直到它到达通道。先插入一根针，然后下面的毛细血管可能促进这一进程。使用快速固化硅铸造佳铸造等复合密封玻璃窗孔。
- 用乙醇和水冲洗渠道，血浆与新鲜清洁，1英寸的圆形为30秒石英盖玻片激活细胞一起。我们建议清洁盖玻片使用食人鱼*.保险丝的盖玻片一侧的细胞含有渠道，密封的商会。
- 离开组装的电池在室温下固化过夜。
*食人鱼是解决方案的H 2 O 2和H 2 SO 4 1:2.5的比例。要干净盖玻片，沉浸在食人鱼在90 ° C为20分钟。
2 - 激活分子固定的表面
核酸研究的，简单的表面固定计划由第一层玻璃或石英盖玻片与生物素标记的牛血清白蛋白（BSA）与链霉亲。这允许被固定在室温天高特异性生物素标记的样本。
- 软管连接，方便的缓冲区，使用注射器和针头注射的毛细血管。
- 注入0.1毫克/毫升的缓冲液中的生物素化的牛血清白蛋白溶液（10毫米的Tris - HCl，pH值8.0，50 mM氯化钠，使用0.02微米的过滤器过滤）进入通道和至少30分钟的孵育。
- 一个流量300-500缓冲液从通道中删除的任何生物素标记的牛血清白蛋白，不小心陷阱箱内任何气泡。
- 注入溶液的0.1毫克/毫升缓冲液和素A和孵育15分钟。然后重复步骤3。
- 流通过一个生物素标记的样本下午3:00-5:00解决方案。执行表面扫描检查的荧光分子的覆盖面。如果有必要，增加样品的浓度，以取得更好的覆盖。孵育10分钟，并重复步骤3。
微流体细胞是安装在机动XY允许粗（高达25毫米）的议案采用直流马达光学编码阶段，并使用两个闭环压电执行器的罚款（1纳米）的议案（Physik公司Instrumente模型M - 014或类似的）。这可以激活表面样品固定之前或之后。
3 - 准备成像缓冲器（IB）
IB由一种酶氧清除系统和三重淬灭，如Trolox的。由于IB是通过不断一夜之间刷新，至少有10毫升，应提前做好准备。
- 准备10毫升0.8％W / V D -葡萄糖，至少有35毫米的Tris - HCl pH值8.0，氯化钠和50毫米，在去离子水。较高浓度的缓冲重要的是有两个原因：溶解Trolox的酸化的解决方案，并也将降低酶反应随着时间的推移溶液的pH值。由于该解决方案具有保质期长，它可以存储作为原液。
- 溶解在5毫克Trolox的振荡几分钟，然后摇晃10分钟，在第1步准备的缓冲区。 Trolox的不是很易溶于水，在pH> 7，所以不要急于这一步。过滤的解决方案，使用一个0.2微米的过滤器，并保持在10分钟的真空脱气。
- 准备通过混合60μL瓦特的“gloxy”酶的解决方案R，20μL5X缓冲，过氧化氢酶20μL，1毫克的葡萄糖氧化酶和100μL10 mg / ml的BSA。使用0.22微米的离心过滤器过滤的解决方案。
- “gloxy”解决方案，避免形成气泡从步骤3，轻轻地从第2步混合缓冲区。
- 使用机械注射泵控制流速在5μL/ min的恒定速率的通道流过的IB。泡泡氩气进入IB水库重新溶解到缓冲区，以防止大气中的氧气。
表面扫描，分子本地化和收购单分子的强度痕迹，是控制一个LabVIEW程序，允许自动数据收集 1 。该计划在0.2μm的分辨率扫描20X20微米2地区，0.1微米/ MS率。数据立即处理，屈服强度加权上述背景计数的所有像素的位置。固定分子一旦被发现，他们都感动到焦的供体和受体荧光基团的数量和强度是记录的时间，直到两个荧光基团的光漂白的功能。编程阶段是移动到一个新的原产地100微米，重复扫描过程。
4 - 代表性的结果
下面是一些组装的微流体细胞表面活化前和安装后，正准备分子固定在显微镜图像显示。如果通道被激活成功，表面扫描应类似于下面显示后直接捐助激发捐助染料（绿色）和受体（红色）的排放所描绘的扫描。这些分子移动一进入探测量，超过时间，直到两个染料的光漂白和荧光记录，在单个分子的痕迹。来自其中之一的痕迹，可以得到的FRET效率，瞬时体 - 受体的分离，这又是用来探索生物的兴趣分子的结构和动态通知。
图1：四通道微流控细胞，每个入口/出口的毛细血管。请点击这里看到图1的放大版本。
图2：安装在显微镜测量准备的细胞。请点击这里看大图图2。
图3：SM - FRET技术测量的设置。图3看到一个更大的版本， 请点击这里。
图4和图5：红色和绿色通道的一个固定的表面扫描FRET绿色激光激发的分子。请点击查看大图图4 ， 图5 。
图6，7，8，9：强度轨迹的捐助（绿色）和受体（红色）标记的一个DNA分子8，10，16和18个碱基对，除了的荧光基团。请点击看到一个更大的版本，图 6 ，图 7 ，图 8 ，图 9 。
Discussion
虽然上述协议已经为我们特定的系统和优化的染料（TMR和ATTO647N）的具体选择，它决不是唯一的证明方法。近日，原儿茶酸（PCA）/ protocatechuate 3,4 -双加氧酶（PCD）组成的替代氧清除系统增加 4某些染料的耐光性。同样，其他如β-巯基乙醇（BME）的三重态的猝灭可以用来代替Trolox的，尽管这些可能无法抑制长期闪烁一些染料，特别是Cy5的5。
虽然固定通过生物 素-链霉菌抗生物素标记的牛血清白蛋白（BSA）是核酸研究的首选，更适合一个聚乙二醇（PEG）涂层表面的蛋白质的研究，因为它可以防止非特异性粘附1。此外，子衍射极限的大小水泡，可用于封装生物分子在利益的案件可以由表面相互作用6的影响。
在这篇文章中，我们已经使用共聚焦设置，配备与硅雪崩光电二极管获得的荧光强度的痕迹。共有配备CCD相机内反射荧光显微镜（TIRF），该协议同样适用。不管使用的显微镜，SM - FRET技术可以告知接近埃时，供体和受体信号的正确纠正 7的空间分辨率。
Acknowledgments
我们感谢他的帮助在开发系统的微流体装置的设计和设置加工零件在哈佛大学罗兰研究所的工作人员的意见，约书亚埃德尔德兰Sabanayagam。我们承认了有益的讨论，与梅勒的研究小组的成员罗兰研究所和波士顿大学，并在伊利诺伊大学的T.房委会“组的成员有用的信息。最后，我们对此表示赞赏从国家科学基金会（PHY - 0701207）和美国国立卫生研究所（GM075893）的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
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