Summary
In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.
Abstract
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopie is op grote schaal gebruikt om de structuur en dynamiek van moleculen van biologische belang, zoals nucleïnezuren en eiwitten te bestuderen. Enkel molecuul FRET (sm-FRET) metingen op geïmmobiliseerd moleculen mogelijk lange opmerkingen van de systeem-effectief totdat beide kleurstoffen photobleach-wat resulteert in tijd-sporen die rapporteren over biomoleculaire dynamiek met een breed scala van tijdschalen van milliseconden tot minuten. Het vergemakkelijken van de overname van grote aantallen sporen voor statistische analyses, moet het proces worden geautomatiseerd en het monster milieu moeten strak worden geregeld over de hele meettijd (~ 12 uur). Dit wordt bereikt met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop waarmee de ondervraging van duizenden enkele moleculen 's nachts, en een microfluïdische cel die de gecontroleerde uitwisseling van buffer vergunningen, met beperkte zuurstofgehalte en zorgt voor een constante temperatuur gedurende de gehele meetperiode. Hier laten we zien hoe het microfluïdische apparaat samenstellen en hoe u het oppervlak voor DNA-immobilisatie te activeren. Dan leggen we uit hoe je een buffer te bereiden op de fotostabiliteit en levensduur van de fluoroforen te maximaliseren. Tot slot, laten we de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van de setup voor de automatische acquisitie van tijdsopgeloste single molecule FRET sporen van DNA-moleculen.
Protocol
1 - Montage van de microfluïdische cel
De microfluïdische cel is gemaakt door het fuseren van een patroon, 2 mm dik, polydimethylsiloxaan (PDMS) schijf naar een schone kwarts dekglas. De PDMS schijf bevat vier 30 ul rechthoekige kamers die worden benaderd door in-en uitlaat flexibel haarvaten verbonden met een buffer reservoir en een spuit pomp, respectievelijk voor de gecontroleerde stroom van buffer. De stroom cel is ondersteund op de achterzijde door een glazen raam en geplaatst op een custom-made cel houder met een watergekoelde thermo-element om de temperatuur te regelen.
- Om het patroon PDMS schijf, 10 delen siliconenelastomeer basis mengen met 1 deel verharder, goed mengen en laat ontgassing gedurende 1 uur in een vacuüm.
- Giet het elastomeer mix op de microfluïdische cel mal. In ons geval is dit een 1 "silicium wafer met vier stroken (1x10 4 x 1x10 3 x 300 urn) gemaakt van negatieve fotolak. Laat dit te genezen op een hete plaat bij 70 ° C gedurende twee uur.
- Zorgvuldig verwijderen de uitgeharde PDMS schijf van de mal met behulp van een scheermesje. De zekering van de schijf naar een 1''raam (met 8 x 2 mm-diameter van voorgeboorde gaten aan beide uiteinden van de kanalen) door plasma oxideren beide oppervlakken gedurende 30 seconden. De zekering van de ramen op de platte kant van de PDMS schijf (de kant zonder de kanalen).
- Plaats een 2-inch lange flexibele fused silica capillaire buis door het gat elk glas venster tot aan het kanaal. Het inbrengen van een naald en vervolgens na met de capillaire kan dit proces vergemakkelijken. Sluit de glazen raam gaten met behulp van een snel uithardende siliconen gieten verbinding zoals Kwik-Cast.
- Spoel de kanalen met ethanol en water, en een plasma-activeren van de cel, samen met een schone, 1-inch ronde quartz dekglas gedurende 30 seconden. We raden reinigen van deze dekglas met piranha *. De zekering van de dekglas aan de zijkant van de cel met de kanalen, het afdichten van de kamers.
- Laat de gemonteerde cel om 's nachts uitharden bij kamertemperatuur.
* Piranha is een oplossing van H 2 O 2 en H 2 SO 4 in 1:2,5 proporties. Voor het reinigen van de dekglaasjes, dompel hen in piranha bij 90 ° C gedurende 20 minuten.
2 - Het activeren van de oppervlakte voor de molecule immobilisatie
Voor nucleïnezuur studies, de eenvoudigste oppervlak immobilisatie regeling bestaat uit een eerste laag glas of kwarts dekglas met gebiotinyleerd bovine serum albumine (BSA) en vervolgens met streptavidine. Hierdoor kan de gebiotinyleerde monster worden geïmmobiliseerd met een hoge specificiteit voor dagen bij kamertemperatuur.
- Sluit de flexibele slang aan de haarvaten voor eenvoudige buffer injectie met een spuit en naald.
- Injecteer een oplossing van 0,1 mg / ml gebiotinyleerd BSA in buffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, gefilterd met 0,02 micrometer filters) in het kanaal en incubeer gedurende tenminste 30 minuten.
- Stroom 300-500 ul buffer A op een gratis gebiotinyleerd BSA te verwijderen uit het kanaal, zorg dat u eventuele luchtbellen in de kamer val.
- Injecteer een oplossing van 0,1 mg / ml streptavidine in buffer A en incubeer gedurende 15 minuten. Herhaal dan Stap 3.
- Stroming door een 3-5 pM oplossing van het gebiotinyleerde monster. Voer een oppervlakte scan om de dekking van fluorescerende moleculen te controleren. Indien nodig, verhoog de steekproef concentratie een betere dekking te krijgen. Incubeer gedurende 10 minuten en herhaal stap 3.
De microfluïdische cel is gemonteerd op een gemotoriseerde xy podium waardoor grof (tot 25 mm) beweging met behulp van optisch gecodeerd DC-motoren, en fijn (1 nm) beweging met behulp van twee closed-loop piëzo-actuatoren (Physik Instrumente model M-014 of iets dergelijks). Dit kan zowel voor of na het activeren van de oppervlakte voor monster immobilisatie worden gedaan.
3 - Voorbereiden van de Imaging Buffer (IB)
De IB bestaat uit een enzymatische zuurstof scavenging-systeem en een triplet quencher, zoals Trolox. Omdat de IB wordt doorgespoeld voortdurend 's nachts, moet ten minste 10 ml worden voorbereid op voorhand.
- Bereid 10 ml 0,8% w / v D-glucose, ten minste 35 mM Tris-HCl pH 8,0 en 50 mM NaCl in gedeïoniseerd water. De hogere concentratie van de buffer is belangrijk om twee redenen: het oplossen van Trolox zal de oplossing verzuren, en de enzymatische reactie zal ook lager de pH van de oplossing in de tijd. Omdat deze oplossing heeft een lange houdbaarheid kan worden opgeslagen als een stamoplossing.
- Los 5 mg van Trolox in de buffer bereid in stap 1 en door vortexen een paar minuten en dan schudden> 10 min. Trolox is niet erg oplosbaar in water bij pH> 7, dus wees niet te snel deze stap. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 um filter en laat ontgassing in vacuum gedurende 10 minuten.
- De voorbereiding van de "gloxy" enzymatische oplossing door het mengen van 60 ul water, 20 ul van 5X buffer A, 20 ul van catalase, 1 mg glucose-oxidase en 100 ul van 10 mg / ml BSA. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 um filter centrifuge.
- Meng de buffer van stap 2 met de "gloxy" oplossing uit stap 3 het vermijden van de vorming van luchtbellen.
- Doorstroming van de IB via het kanaal met een constante snelheid van 5 pl / min met behulp van een mechanische pomp spuit met het debiet te controleren. Bubble argon gas in het IB reservoir tot atmosferische zuurstof te voorkomen dat opnieuw oplost in de buffer.
Het oppervlak scannen, molecule lokalisatie en de verwerving van single molecule intensiteit sporen wordt bestuurd door een LabView programma dat geautomatiseerde gegevensverzameling een vergunningen. Het programma scant 20x20 um twee gebieden op 0,2 micrometer resolutie, met een snelheid van 0,1 micrometer / ms. De gegevens worden direct verwerkt de intensiteit van de gewogen locaties van alle pixels boven de achtergrond telt opbrengst. Zodra de geïmmobiliseerde moleculen worden gevonden, worden ze verplaatst een voor een in de confocale volume en de intensiteit van de donor en acceptor fluorofoor worden geboekt als een functie van de tijd totdat beide fluoroforen photobleach. Het podium is dan geprogrammeerd om te verhuizen naar een nieuwe oorsprong 100 um weg, en het scanproces wordt herhaald.
4 - representatieve resultaten
Hieronder staan een aantal beelden die de verzamelde microfluïdische cel voor oppervlakte-activatie en nadat ze gemonteerd op de microscoop klaar voor molecuul immobilisatie. Als het kanaal is succesvol geactiveerd, moet het oppervlak scans zijn vergelijkbaar met de scans hieronder afgebeeld met de emissie van de donor kleurstof (groen) en acceptor (rood) na directe donor excitatie. Deze moleculen worden verplaatst een voor een in het sonderen volume en de fluorescentie opgenomen na verloop van tijd totdat beide kleurstoffen photobleach, zoals in de single molecule sporen. Van sporen als deze kan men verkrijgen van de FRET efficiëntie, die informeert over de ogenblikkelijke donor-acceptor scheiding, die op zijn beurt wordt gebruikt om de structuur en de dynamica van moleculen van biologisch belang te verkennen.
Figuur 1: Microfluïdische cel met vier kanalen, elk met inlaat / uitlaat haarvaten. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
Figuur 2: Cel gemonteerd op de microscoop klaar voor metingen. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.
Figuur 3: Instellingen voor sm-FRET metingen. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 3 te zien.
Figuren 4 en 5: Rode en groene kanaal van een scan van het oppervlak geïmmobiliseerde FRET moleculen blij met groene laser. Klik voor een grotere versie te zien van figuur 4 , of figuur 5 .
Figuren 6, 7, 8 en 9: Intensiteit trajecten van de donor (groen) en acceptor (rood) fluoroforen gelabeld om een DNA-molecuul 8, 10, 16 en 18 baseparen van elkaar. Klik voor een grotere versie te zien van figuur 6 , figuur 7 , figuur 8 , of figuur 9 .
Discussion
Hoewel de bovenstaande protocol is geoptimaliseerd voor ons eigen systeem en voor een specifieke keuze van kleurstoffen (TMR en ATTO647N), het is niet het enige bewezen methode. Onlangs is een alternatief zuurstof wegvangen bestaande uit protocatechuic zuur (PCA) / protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PCD) laten zien dat de fotostabiliteit van bepaalde kleurstoffen vier te verhogen. Ook kunnen andere triplet-toestand quenchers, zoals β-mercapto-ethanol (BME) in plaats van Trolox worden gebruikt, hoewel deze misschien niet onderdrukken langdurig knipperen van sommige kleurstoffen, in het bijzonder Cy5 5.
Hoewel de immobilisatie via biotine-streptavidine-gebiotinyleerde bovine serum albumine (BSA) is de beste keuze voor nucleïnezuren studies, is een polyethyleenglycol (PEG)-coating beter geschikt voor onderzoek van eiwitten, omdat het voorkomt dat niet-specifieke aanhechting 1. Bovendien kunnen sub-diffractie-beperkte grootte blaasjes worden gebruikt om de biomolecuul van belang in de gevallen waar het kan worden beïnvloed door oppervlakte-interacties 6 in te kapselen.
In dit artikel hebben we gebruik gemaakt van een confocale opstelling uitgerust met siliconen lawine fotodiodes om de fluorescentie-intensiteit sporen te verwerven. Dit protocol werkt even goed met Total Internal Reflection fluorescentiemicroscopen (TIRF), uitgerust met CCD-camera's. Ongeacht de gebruikte microscopie, sm-FRET kunnen informeren over de ruimtelijke resoluties het naderen van de ångström wanneer de donor en acceptor signaal juist gecorrigeerd 7.
Acknowledgments
Wij danken Chandran Sabanayagam voor zijn hulp bij de ontwikkeling van het systeem, Joshua Edel voor advies over het ontwerpen van de microfluïdische apparaat en de medewerkers van het Instituut Rowland aan de Harvard University voor de bewerking delen van de installatie. Wij erkennen nuttige discussies met leden van de groep Meller's op de Rowland Instituut en aan Boston University, en leden van T. Ha 's groep UIUC voor nuttige informatie. Tot slot, we waarderen de financiële steun van de National Science Foundation (PHY-0701207) en het National Institute of Health (GM075893).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
