Summary
En este artículo se describe cómo obtener FRET rastros de moléculas individuales de ADN inmovilizado en una superficie utilizando un microscopio confocal de barrido automático.
Abstract
Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) microscopía se ha utilizado ampliamente para estudiar la estructura y dinámica de las moléculas de interés biológico, tales como los ácidos nucleicos y proteínas. Sola molécula FRET (sm-FRET) mediciones en las moléculas inmovilizadas permitir observaciones de largo del sistema de forma efectiva hasta que ambos colorantes photobleach-que resulta en el tiempo las huellas que el informe sobre la dinámica de biomoléculas con una amplia gama de escalas de tiempo de milisegundos a minutos. Para facilitar la adquisición de gran número de huellas para el análisis estadístico, el proceso debe ser automatizado y el medio ambiente de la muestra debe ser estrechamente controlada por el tiempo de medición completa (~ 12 horas). Esto se logra utilizando un microscopio confocal de barrido automático que permite el interrogatorio de miles de moléculas individuales durante la noche, y una célula de microfluidos que permite el intercambio controlado de tampón, con el contenido de oxígeno restringido y mantiene una temperatura constante durante todo el período de medición. Aquí se muestra cómo montar el dispositivo de microfluidos y de cómo activar su superficie para la inmovilización de ADN. A continuación se explica cómo preparar un amortiguador para maximizar la fotoestabilidad y la duración de los fluoróforos. Finalmente, se muestran los pasos a seguir en la preparación de la instalación para la adquisición automática de la resolución temporal sola molécula FRET trazas de moléculas de ADN.
Protocol
1 - Montaje de las células de microfluidos
La célula de microfluidos se hace mediante la fusión de un patrón, 2 mm de espesor, polidimetilsiloxano (PDMS) de disco en una hoja de cubierta de cuarzo recién limpiado. El disco contiene cuatro PDMS 30 cámaras l rectangular que se accede por la entrada y salida flexibles capilares conectado a un tanque de regulación y una bomba de jeringa, respectivamente, para el control de flujo de buffer. La celda de flujo es compatible con su parte trasera por una ventana de vidrio y colocado en un soporte de la celda a medida que contiene un elemento termoeléctrico refrigerado por agua para regular la temperatura.
- Para hacer que el patrón PDMS disco, mezcla de 10 partes de base de elastómero de silicona con un agente de curado parte, mezclar bien y dejar de desgasificación durante 1 hora en el vacío.
- Suavemente vierta la mezcla en el molde elastómero de células de microfluidos. En nuestro caso, se trata de una una "oblea de silicio con cuatro tiras (1x10 1x10 4 x 3 x 300 m) a partir de fotosensible negativa. Deje esta para curar en un plato caliente a 70 ° C durante dos horas.
- Retire con cuidado el disco curado PDMS del molde con una cuchilla de afeitar. Fundir el disco en una ventana de vidrio de 1''(que contiene 8 x 2 mm de diámetro los agujeros previamente perforados en ambos extremos de los canales) por plasma oxidante ambas superficies durante 30 segundos. Fusionar las ventanas de cristal en el lado plano del disco PDMS (el lado que no contengan los canales).
- Inserte una de 2 pulgadas de largo tubo flexible capilar de sílice fundida a través del agujero de cada ventana de vidrio, hasta que llegue al canal. Inserción de una aguja y luego sigue con el capilar puede facilitar este proceso. Selle los orificios ventana de cristal con un compuesto de curado rápido de fundición de silicona tales como Kwik-Cast.
- Enjuague los canales con etanol y agua, y el plasma a activar la célula, junto con un recién limpiada, de 1 pulgada de deslizamiento circular cubierta de cuarzo de 30 segundos. Le recomendamos la limpieza de esta hoja de cubierta con pirañas *. Fusionar la hoja de la cubierta al lado de la celda que contiene los canales, sellado de las cámaras.
- Salir de la celda se reunieron para curar toda la noche a temperatura ambiente.
* Piranha es una solución de H 2 O 2 y H 2 SO 4 en proporciones 1:2,5. Para limpiar la cubierta se desliza, lavarlos en pirañas a 90 ° C durante 20 min.
2 - Activación de la superficie para la inmovilización de moléculas
Para los estudios de ácido nucleico, el esquema de la superficie más simple consiste en la inmovilización primera capa un vaso o una hoja de cubierta de cuarzo con biotina albúmina de suero bovino (BSA) y luego con estreptavidina. Esto permite que la muestra con biotina a ser inmovilizada con una alta especificidad para el día a temperatura ambiente.
- Conecte el tubo flexible de los capilares de inyección de tampón fácil con una jeringa y aguja.
- Se inyecta una solución de 0,1 mg / ml de BSA biotina en un buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, se filtra con filtros de 0,02 micras) en el canal y se incuba durante al menos 30 minutos.
- Flujo de 300 a 500 l de tampón A para eliminar cualquier BSA biotina libre de los canales, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire dentro de la cámara.
- Se inyecta una solución de 0,1 mg / ml de estreptavidina en un buffer y se incuba durante 15 min. Luego repita el paso 3.
- El flujo a través de una solución 5.3 pM de la muestra con biotina. Realizar una exploración de superficie para verificar la cobertura de moléculas fluorescentes. Si es necesario, aumentar la concentración de la muestra para obtener una mejor cobertura. Incubar durante 10 minutos y repita el paso 3.
La célula de microfluidos está montado sobre una platina motorizada xy permite grueso (de hasta 25 mm) de movimiento con óptica codificada motores de corriente continua y fina (1 nm) de movimiento con dos de circuito cerrado actuadores piezoeléctricos (Physik Instrumente modelo M-014 o similar). Esto se puede hacer antes o después de la activación de la superficie para la inmovilización de la muestra.
3 - Preparación de la memoria intermedia de imagen (IB)
El IB se compone de un sistema de oxígeno enzimática de barrido y un extintor de triplete, como Trolox. Desde el IB pasa a través del constante durante la noche, por lo menos 10 ml deben estar preparados de antemano.
- Prepare 10 ml de 0,8% w / v D-glucosa, por lo menos 35 mM Tris-HCl pH 8,0 y 50 mM de NaCl en agua destilada. La mayor concentración de buffer es importante por dos razones: Trolox disolución se acidifica la solución, y la reacción enzimática, también disminuirá el pH de la solución a través del tiempo. Puesto que esta solución tiene una larga vida útil que se puede almacenar como una solución de reserva.
- Disuélvanse 5 mg de Trolox en el buffer preparado en el paso 1 por agitación durante un par de minutos y luego agitar durante> 10 min. Trolox no es muy soluble en agua a pH> 7, por lo que no se apresure este paso. Filtrar la solución con un filtro de 0,2 micras y dejar de desgasificación al vacío durante 10 minutos.
- Prepare el "gloxy" solución enzimática mediante la mezcla de 60 l water, 20 l de tampón 5X A, 20 l de catalasa, una glucosa oxidasa mg y 100 l de 10 mg / ml de BSA. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 micras centrífuga.
- Mezclar suavemente el buffer de la etapa 2, "gloxy" solución desde el paso 3 para evitar la formación de burbujas de aire.
- El flujo de la IB a través del canal a una velocidad constante de 5 l / min utilizando una bomba de inyección mecánica para controlar el caudal. Burbuja de gas argón en el depósito de IB para evitar que el oxígeno del aire se vuelva a disolver en el buffer.
La exploración de la superficie, localización de la molécula y la adquisición de una sola molécula de huellas intensidad es controlada por un programa de LabView que permite la recopilación de datos automatizados 1. El programa escanea 20x20 m 2 zonas con una resolución de 0,2 micras, con una tasa de 0,1 m / ms. Los datos son procesados inmediatamente para obtener la intensidad ponderada por la ubicación de todos los píxeles por encima de los recuentos de fondo. Una vez que las moléculas se encuentran inmovilizados, se mueven el uno por uno en el volumen confocal y las intensidades de los donantes y fluoróforo aceptor se registran como una función del tiempo hasta que ambos photobleach fluoróforos. El estadio está programado para pasar a un nuevo origen 100 m de distancia, y el proceso de exploración se repite.
4 - Resultados de la Representante
A continuación se muestran algunas imágenes que muestran las células de microfluidos montado antes de la activación de superficie y después de ser montado en el microscopio listo para la inmovilización de moléculas. Si el canal se activa con éxito, escanea la superficie debe ser similar a los escáneres se muestra a continuación muestra las emisiones de los donantes colorante (verde) y receptor (rojo) después de la excitación directa de los donantes. Estas moléculas se mueven de uno en uno en el volumen de sondeo y la fluorescencia se registra el paso del tiempo hasta que ambos photobleach colorantes, como se muestra en los rastros sola molécula. A partir de las huellas como éstas se puede obtener la eficiencia de FRET que informa sobre la instantánea donante-aceptor de separación, que a su vez se utiliza para explorar la estructura y dinámica de las moléculas de interés biológico.
Figura 1: células de microfluidos con cuatro canales, cada uno con entrada / salida de los capilares. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.
Figura 2: Cell montado en el microscopio listo para las mediciones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2.
Figura 3: Configuración de los SM-FRET mediciones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 3.
Las figuras 4 y 5: canal rojo y el verde de una exploración de superficie de inmovilizado FRET moléculas excitadas con láser verde. Por favor, haga clic para ver una versión ampliada de la figura 4 , o la figura 5 .
Figuras 6, 7, 8 y 9: Intensidad de las trayectorias de los donantes (verde) y aceptor (rojo) fluoróforos etiqueta a una molécula de ADN 8, 10, 16 y 18 pares de bases de distancia. Por favor, haga clic para ver una versión ampliada de la figura 6 , figura 7 , figura 8 , o la figura 9 .
Discussion
Aunque el protocolo anterior ha sido optimizado para el sistema en particular y para una elección específica de los tintes (TMR y ATTO647N), que no es el único método probado. Recientemente, un sistema de oxígeno alternativos de barrido que consiste en ácido protocatéquico (PCA) / protocatechuate-3 ,4-dioxigenasa (PCD) ha demostrado aumentar la fotoestabilidad de determinados colorantes 4. Del mismo modo, otro estado triplete, como apagar la β-mercaptoetanol (BME) se puede utilizar en lugar de Trolox, aunque no podría suprimir de larga duración intermitente de algunos colorantes, en particular, Cy5 5.
A pesar de la inmovilización a través de biotina-estreptavidina-biotina albúmina de suero bovino (BSA) es la opción preferida para los estudios de los ácidos nucleicos, un polietilenglicol (PEG)-superficie cubierta es más adecuado para los estudios de las proteínas, ya que evita adhesión no específica 1. Además, la difracción de sub-limitada-vesículas de tamaño se puede utilizar para encapsular las biomoléculas de interés en los casos en que puede verse afectada por las interacciones de superficie 6.
En este artículo hemos utilizado una configuración confocal equipado con silicona fotodiodos de avalancha para adquirir las huellas intensidad de la fluorescencia. Este protocolo funciona igual de bien con el total de los microscopios de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) equipados con cámaras CCD. Independientemente de la microscopía de utilizar, sm-FRET puede informar sobre la resolución espacial se acerca el angstrom cuando el donante y el receptor de la señal están debidamente corregido el 7.
Acknowledgments
Damos las gracias a Chandran Sabanayagam por su ayuda en el desarrollo del sistema, Josué Edel para el asesoramiento en el diseño del dispositivo de microfluidos y el personal del Instituto Rowland en la Universidad de Harvard para el mecanizado de piezas de la instalación. Reconocemos conversaciones útiles con los miembros del grupo Meller, en el Instituto Rowland y la Universidad de Boston, y los miembros del grupo T. Ha 's de la UIUC para obtener información útil. Finalmente, agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias (PHY-0701207) y el Instituto Nacional de Salud (GM075893).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
