Summary
이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
형광 공명 에너지 전달은 (무서워) 현미경이 널리 등 핵산 및 단백질과 같은 생물 학적 관심 분자의 구조와 역학을 연구하는 데 사용되었습니다. 단일 분자가 고정화 분자의 (SM - 프렛) 측정을 걱정하는 것은 오랜 관찰을 허용 시스템 효과적으로 모두 염료가 시간 흔적으로 photobleach - 결과까지 그 분 밀리초에서 timescales 광범로 biomolecular 역학에 대한 리포트입니다. 통계 분석에 대한 흔적을 다수의 인수를 촉진하기 위해 프로세스가 자동화되어야하며 샘플 환경을 단단히 전체 측정 시간 (~ 12 시간)를 통해 제어되어야합니다. 이것은 단일 분자의 수천의 심문은 밤새 수있는 자동 스캔 공촛점 현미경, 그리고 제한된 산소 컨텐츠와 버퍼의 제어 교류를 허용하고 전체 측정 기간 동안 일정한 온도를 유지 microfluidic 세포를 사용하여 수행됩니다. 여기서 우리는 microfluidic 장치를 조립하는 방법과 DNA를 고정에 대한 표면을 활성화하는 방법을 보여줍니다. 그럼 우리가 fluorophores의 photostability과 수명을 최대화하기 위해 버퍼를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 시간이 해결 단일 분자의 자동 수집을 위해 설치 준비에 관련된 단계는 DNA 분자의 흔적이 무서워 보여.
Protocol
1 - microfluidic 셀을 조립
microfluidic 세포가 융합하여 만든 패턴, 갓 청소 석영 커버 슬립에 두께 2mm, polydimethylsiloxane (PDMS) 디스크. PDMS 디스크는 버퍼의 제어 흐름, 각각 버퍼 저수지와 주사기 펌프에 연결된 입구와 콘센트 유연한 모세 혈관으로 액세스할 4 가지 30 μl 사각형 실이 포함되어 있습니다. 흐름 세포는 유리 창문하여 뒷면에 지원하고 온도를 조절하기 위해 열전 요소를 냉각 물을 포함하는 사용자 정의 만든 셀 홀더에 배치됩니다.
- 패턴 PDMS 디스크를 만들려면 1 부분 경화 에이전트 10 부품 실리콘 엘라스토머 기지를 섞어 잘 혼합하고 진공에서 1 시간 동안 degassing 둡니다.
- 부드럽게 microfluidic 전지 금형에 엘라스토머 믹스를 부어. 우리의 경우, 이것은 부정적인 포토 레지스트로 만든 네 스트립 (1x10 1x10 4 X 3 X 300 μm의)와 1 "실리콘 웨이퍼이다. 70 뜨거운 접시에 치료 맡겨 ° C가 두 시간 동안.
- 조심스럽게 면도날을 사용하여 금형의 치료 PDMS 디스크 껍질. 30 초 동안 양쪽 표면을 산화 플라즈마에 의해 1 '유리 창 (채널의 양쪽에 8 X 2mm 지름 사전 뚫고 구멍을 포함)에 디스크를 융합. PDMS 디스크의 평면쪽으로 유리 창문을 (채널을 포함하지 않는 측면) 퓨즈.
- 이 채널에 도달할 때까지 각각의 유리 창문의 구멍을 통해 2 인치 긴 유연한 융합 실리카 모세관 튜브를 삽입합니다. 먼저 바늘을 삽입 후 모세관과 함께 다음과 같은 것은이 과정을 촉진 수도 있습니다. 퀵 - 캐스트와 같은 빠른 경화 실리콘 주조 화합물을 사용하여 유리 창 구멍을 밀봉합니다.
- 에탄올과 물을 채널 린스, 30 초 동안 갓 청소, 1 인치 원형 석영 커버 슬립과 함께 셀 플라즈마 활성화. 우리는 피라 냐는 물고 기지 너한테 줄을 사용하여이 표지 전표 청소 제안 *. 챔버 스를 밀폐, 채널을 포함하는 세포의 측면에 커버 슬립을 후세.
- 실온에서 하룻밤 치료 조립 세포를 남겨주세요.
* 피라 냐가 H 2 O 2, H 1:2.5 비율 2 SO 4의 솔루션입니다. 커버 전표를 청소하려면 90에서 피라 냐는 물고 기지 너한테에 젖어 ° C를 20 분.
2 - 분자 고정을 위해 표면을 활성화
핵산 연구의 경우 단순한 표면 고정 제도는 먼저 코팅의 유리 또는 biotinylated 소 혈청 (BSA) 알부민 후 streptavidin과 함께 석영 커버 슬립을 구성되어 있습니다. 이것은 biotinylated 샘플은 상온에서 일 높은 특이성과 함께 움직일 수 있습니다.
- 주사기와 바늘을 사용하여 쉽게 버퍼 주사에 대한 모세 혈관 유연한 튜빙을 연결합니다.
- 0.1 버퍼 biotinylated BSA의 MG / ML의 솔루션을 주사 (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 50 MM NaCl는 0.02 μm의 필터를 사용하여 필터링) 적어도 30 분 채널과 부화에.
- 버퍼의 흐름 300-500 μl은 챔버 내부에 기포가 트랩되지 않도록주의하고, 채널에서 모든 무료 biotinylated BSA를 제거합니다.
- 0.1의 솔루션을 주사 버퍼에 MG / streptavidin의 ML 15 분 알을 품다. 그런 다음 3 단계를 반복합니다.
- biotinylated 샘플의 3-5 PM 솔루션을 통해 흐름. 형광 분자의 범위를 확인하기 위해 표면 검사를 수행합니다. 필요하다면, 더 나은 보험을 얻기 위해 샘플 농도를 높일 수 있습니다. 10 분 부화하고 3 단계를 반복합니다.
microfluidic 세포는 광학 인코딩 DC 모터를 사용하여 정밀 (최대 25mm) 운동을 허용하는 전동 XY 스테이지에 탑재하고, 고급 (1 NM) 모션 두 폐루프 압전의 액츄에이터를 사용하는 (Physik Instrumente 모델 M - 014 또는 이와 유사한 것). 이 중 앞이나 샘플 고정을 위해 표면을 활성화하면 할 수 있습니다.
3 - 이미징의 버퍼 (IB)를 준비
IB는 Trolox으로 효소 산소 청소 시스템과 트리 플렛 끄는로 이루어져 있습니다. IB가 지속적으로 하룻밤을 통해 플러시되기 때문에, 적어도 10 ML은 사전에 준비되어야합니다.
- 0.8 % 10 ML W / V D - 글루코오스, 적어도 35 MM 트리스 - HCL 산도 8.0 탈이온수에 NaCl 50 MM를 준비합니다. 버퍼의 높은 농도는 두 가지 이유 때문에 중요하다 : 해소 Trolox는 솔루션을 시어지다되며, 효소 반응은 시간이 지남에 따라 솔루션의 산도를 낮춰드립니다. 이 솔루션은 긴 수명을 가지고 있기 때문에 그것은 주식 솔루션으로 저장할 수 있습니다.
- 몇 분 동안 vortexing 후> 10 분 흔들어하여 1 단계에서 준비 버퍼에 Trolox 5 MG를 디졸브. Trolox는 산도> 7 시에 물에 매우 용해되지 않으므로이 단계를 서두 르 지마. 0.2 μm의 필터와 10 분 진공 degassing두고 사용하여 솔루션을 필터링합니다.
- 60 μl 웨이트를 혼합하여 "gloxy"효소 솔루션을 준비R, 5 배 버퍼 A, 카탈 라 아제 20 μl, 1 MG 포도당 산화 효소와 10 100 μl가 MG / ML BSA 20 μl. 0.22 μm의의 원심 분리기 필터를 사용하여 솔루션을 필터링합니다.
- 부드럽게 공기 거품의 형성을 피하기 위해 3 단계에서 "gloxy"솔루션과 함께 2 단계에서 버퍼를 섞는다.
- 흐름 속도를 제어하는 기계 주사기 펌프를 사용하여 5 μl / 분 일정한 속도로 채널을 통해 IB를 흐름. 버퍼로 다시 용해에서 대기 산소를 방지하기 위해 IB 저수지에 거품이 아르곤 가스.
표면 검사, 단일 분자 강도 흔적의 분자 현지화 및 인수는 자동 데이터 수집 1 수 LabView 프로그램에 의해 제어됩니다. 이 프로그램은 0.1 μm의 / MS의 속도, 0.2 μm의 해상도에서 20x20 μm의 두 영역을 검색합니다. 데이터는 즉시 강도 - 가중 배경 카운트 위의 모든 픽셀의 위치를 얻을 수로 처리됩니다. 고정화 분자가 발견되면, 그들은 공촛점 볼륨 및 기증자와 수용체의 형광단의 농도로 하나 하나가 모두 fluorophores의 photobleach 때까지 시간의 함수로 기록 이동됩니다. 단계는 다음 100 μm의 거리에 새로운 기원로 이동 프로그램이며, 스캔 과정은 반복됩니다.
4 - 대표 결과
아래 표면 활성화 이전과 분자 고정 준비 현미경에 장착 후에 조립 microfluidic 세포를 보여주는 몇 가지 이미지가있다. 채널이 성공적으로 활성화되면, 표면 검사 직접 기증 여기 후 기증자 염료 (녹색)와 수용체 (빨간색)의 방출을 보여주는 아래 그려져 스캔과 유사해야합니다. 이러한 분자는 탐색 볼륨으로 하나씩 이동하며 형광이 두 염료의 photobleach 때까지 시간이 지남에 기록됩니다 단일 분자 흔적에 표시됩니다. 다음과 같은 성분부터 차례로 생물 학적 관심의 분자의 구조와 역학을 탐구하는 데 사용되는 순간 기증자 - 수용체의 분리에 알려줍 걱정 효율성을 얻을 수 있습니다.
그림 1 : 네 채널 Microfluidic 세포, 입구 / 출구 모세 혈관 각. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2 : 측정 준비 현미경에 장착 휴대폰. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 3 : SM - 안달 측정을위한 설정. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 3의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 4와 5 : 고정의 표면 검사의 빨간색과 초록색 채널 녹색 레이저로 흥분 분자를 무서워. 더 큰 버전을 보려면 클릭하세요 그림 4 , 또는 그림 5 .
피규어 6, 7, 8, 9 : 기증자의 강도 궤도 (녹색)와 DNA 분자 8, 10, 16, 간격 18 basepairs에 표시된 수용체 (적색) fluorophores. 의 더 큰 버전을 보시려면 클릭하세요 그림 6 , 그림 7 , 그림 8 , 또는 그림 9 .
Discussion
위의 프로토콜의 특정 시스템 및 염료 (TMR 및 ATTO647N)의 구체적인 선택을 위해 최적화되어 있지만, 그것없이는 유일한 입증 방법을 의미하는 것입니다. 최근 protocatechuic 산성 (PCA) / protocatechuate - 3 ,4 - dioxygenase (PCD)의 구성 대체 산소 청소 시스템은 특정 염료 4 photostability를 증가 표시했다. 이들은 특히 Cy5 5, 일부 염료의 지속적인 점멸을 억제하지 않을 수도 있지만, 이와 같은 β - 메르 캅 토 에탄올 (BME) 같은 다른 플렛 - 상태 quenchers는 대신 Trolox에 사용할 수 있습니다.
(BSA) 비오틴 - streptavidin - biotinylated 소 혈청 알부민을 통해 고정이 핵산 연구에 대한 선호하는 선택지만 그것이 아닌 구체적인 접착력 1 방지할 수 있기 때문에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 코팅 표면이 좋은 단백질의 연구에 가장 적합합니다. 또한 하위 회절 - 제한된 크기 vesicles 그것은 표면의 상호 작용 6에 의해 영향을받을 수있는 경우에 관심 생분자을 캡슐 화하는 데 사용할 수 있습니다.
이 문서에서 우리는 형광 강도 흔적를 얻기위한 실리콘 애벌란치 photodiodes 갖춘 공촛점 설정을 사용합니다. 이 프로토콜은 CCD 카메라가 장착된 총 내부 반사 형광 현미경의 (TIRF)와 동일하게 작동합니다. 에 관계없이 현미경의 사용, 기증자 및 수용체의 신호가 올바르게 7 수정 때 앵스트롬 접근 공간적 해상도에 알려줄 수 SM - 초조해.
Acknowledgments
우리는 시스템 microfluidic 장치를 설계에 대한 조언과 설치의 가공 부품 하버드 대학에서 롤랜드 연구소에서 직원 조슈아 에델 개발에 자신의 도움을 Chandran Sabanayagam 감사합니다. 우리는 유용한 정보를 UIUC에서 유용 롤랜드 연구소와 보스턴 대학에서 멜러 그룹의 회원들과 토론하고, T. 하의 그룹의 구성원을 인정합니다. 마지막으로, 우리는 국립 과학 재단 (PHY - 0701207) 및 보건 국립 연구소 (GM075893)에서 재정 지원을 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
