Zuivering van specifieke cel Bevolking naar fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)

Summary

Voor veel wetenschappelijke studies die een biologische en chemische analyse van celpopulaties de cellen moeten worden in een hoge staat van zuiverheid. Fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) is een superieure methode om zuivere celpopulaties te verkrijgen.

Abstract

Experimentele en klinische studies vereisen vaak sterk gezuiverde celpopulaties. FACS is een techniek bij uitstek om celpopulaties van bekende fenotype te zuiveren. Andere bulk methoden van zuivering zijn panning, complement uitputting en magnetische kraal scheiding. Echter, FACS heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere beschikbare methoden. FACS is de beste methode bij zeer hoge zuiverheid van de gewenste bevolking nodig is, wanneer de doelcel bevolking een zeer laag niveau van de identificerende marker drukt of als de cel populaties moeten worden afgezonderd op basis van differentiële marker dichtheid. Daarnaast, FACS is de enige beschikbare techniek voor de zuivering cellen op basis van interne vlekken of intracellulaire eiwit expressie, zoals het een genetisch gemodificeerd fluorescerend eiwit marker te isoleren. FACS maakt de zuivering van de individuele cellen op basis van grootte, korreligheid en fluorescentie. Om de cellen van belang te zuiveren, worden ze eerst gekleurd met fluorescent-gemerkte monoklonale antilichamen (mAb), die specifieke oppervlakte markers op de gewenste cel bevolking (1) te erkennen. Negatieve selectie van ongekleurde cellen is ook mogelijk. FACS zuivering vereist een flowcytometer met het sorteren van de capaciteit en de juiste software. Voor FACS, worden de cellen in suspensie doorgegeven als een stroom in druppeltjes met elk een afzonderlijke cel in de voorkant van een laser. De fluorescentie detectie systeem detecteert de cellen van belang op basis van vooraf bepaalde fluorescerende parameters van de cellen. Het instrument is van toepassing ten laste van de druppel met een cel van belang en een elektrostatische afbuiging systeem faciliteert collectie van de geladen druppeltjes in de juiste verzameling buizen (2). Het succes van kleuring en daarmee sorteren hangt grotendeels af van de keuze van de identificerende markers en de keuze van mAb. Sorteren parameters kunnen worden aangepast afhankelijk van de eis van zuiverheid en opbrengst. Hoewel de FACS vereist gespecialiseerde apparatuur en opleiding van personeel, het is de methode van keuze voor isolatie van sterk gezuiverde celpopulaties.

Protocol

Voordat u begint met het proces, de volgende items dienen te worden om verzameld en voorbereid: Ijs 15 ml conische buizen voor kleuring cellen en 12 x 75 mm stroom buizen voor het beitsen van enkele kleur controles. Vlekken buffer: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) + 3% foetaal kalf serum (FCS) Pipetten Fc blok (indien nodig) en vlekken antilichamen. Antilichamen moeten worden getitreerd voor een optimale kleuring. Compensatie kralen Vering buffer: Balanced Salt Hank's Solution (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS Trypan blauw en hemocytometer Cel zeef (40 um Nylon) Collectie buizen: twee soorten collectie buizen kunnen worden gebruikt a) 12 x 75 mm polystyreen buizen (die 300 ul FCS en 25 mM HEPES) of b) 15 ml conische buizen (met 1 ml FCS + 25 mM HEPES). Elke rijk medium met een hoge serum-concentratie kan worden gebruikt voor het verzamelen van de gesorteerde cellen. Het genereren van een enkele cel opschorting van de start celpopulatie. Optioneel: Verrijk voor de gewenste celpopulatie met een bulk-zuivering methode zoals aanvulling op uitputting of magnetisch sorteren. Het belangrijkste voordeel van de verrijking stap is dat het het soort tijd vermindert. Een keer wassen cellen met vlekken buffer. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in vlekken buffer bij een concentratie van maximaal 50 x 10 6 voor een efficiënte kleuring. Optioneel: Voor cellen die een hoge mate van FcR, blokkeren de receptoren te blokkeren met behulp van een geschikte methode. Een methode van keuze is het gebruik van een mAb dat zich bindt aan op ijs FcγR gedurende 10-15 minuten. Deze antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar. Voeg de juiste mAb (bij een vooraf bepaalde concentratie) om de gewenste celpopulatie vlek en voor 20-30 min op ijs in het donker, gevolgd door twee wassen met vlekken buffer incuberen. Optioneel: Kleuren met een vitale kleurstof, zoals propidiumjodide, kunnen worden opgenomen om de dode cellen (5) te onderscheiden. Als multi-color kleuring is om te worden gebruikt, zijn enkele kleur controles daarop. We maken gebruik van BD CompBeads om een ​​kleur controles voor te bereiden met behulp van protocol van de fabrikant. Als u geen direct geconjugeerde antilichamen, herhaal dan stap 7 met behulp van de passende secundaire antilichaam of streptavidine conjugaat. Na het wassen, resuspendeer de cellen in kweekmedium en bepaal de cel concentratie met behulp van een vitale kleurstof, zoals trypan blauw. Pas de cel concentratie tot 15-20 x 10 6 / ml. Voor de celpopulaties die vorm clusters, die het instrument kunnen verstoppen tijdens het sorteren, de cellen filter door een zeef. Het opzetten en optimaliseren van de cel sorter. Het proces van het opzetten van een flowcytometer is gevarieerd, afhankelijk van de productie en moet worden uitgevoerd door adequaat opgeleid personeel. De algemene aanbevelingen zijn als volgt: Selecteer de juiste mondstuk, afhankelijk van het celtype te worden gesorteerd. Voor steriele soorten, steriliseren het instrument. Voer instrument voor kwaliteitscontrole met kralen om te controleren of lasers zijn functioneren, en het is nauwkeurig sorteren. Installeer de vereiste collectie apparaat en het opzetten van de kant stromen. Kijk naar laser van het instrument en de detector opgezet om de fluorescente labels die kunnen worden gebruikt (onze BD FACS Aria heeft drie lasers en kan detecteren tot negen kleuren) te bepalen. Als het eenmaal is bepaald wat fluorescerende labels zullen worden gebruikt op de celsorteerder, kan schadevergoeding worden uitgevoerd (zoals hieronder uitgelegd). Voer vergoeding gebruik van de negatieve controle monster en de single positieve controles. Compensatie is nodig om het spectrum overlap tussen de twee detectoren te verwijderen. Is het relevant op te merken dat de compensatie niet dwaas bewijs en wordt negatief beïnvloed door hoe fel bepaalde markers vlek, en door de fluorescentie van cellen die een lage autofluorescentie wat kan leiden tot een slechte resolutie tussen dim en de negatieve populaties hebben. Voor de beste resultaten moet de experimentele opzet omvatten het gebruik van heldere fluorochromen met markers die lage expressie hebben of die niet beschikken over een bekend kleuringspatroon. Markers die een goede scheiding tussen celpopulaties en zijn hoog tot expressie te bieden moet worden gebruikt met een dimeer fluorochromen zoals die opgewonden door rood of violet lasers. Compensatie kan worden uitgevoerd met compensatie kralen, die zijn polystyreen microdeeltjes die zijn gekoppeld aan een antilichaam dat specifiek is voor de Kappa lichte keten van Ig van muis, rat, of ratten / hamster. De parels zijn gemakkelijk te vlek, hebben een robuust signaal en bieden een eenvoudige manier te bereiden enkele gekleurde controles die de dezelfde fluorofoor als de experimentele monsters. Stel een sjabloon dat een bivariaat complot om voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC), en een histogram weer te geven voor onderelke fluorochroom die zullen worden gebruikt. Voer de negatieve controle buis en pas de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) aan de bevolking van de rente op schaal plaats. Pas de fluorescentie PMT instellingen om de negatieve bevolking of autofluorescentie in het uiterste linker gedeelte van het histogram plaats. Noteer de negatieve controle buis. Voer de single positieve controle buizen en noteer de data voor elke buis. Teken een interval hek rondom het positieve deel van de gegevens op het histogram, en een ander interval hek aan de negatieve gedeelte van het histogram. Handmatige compensatie wordt gedaan door het aanpassen van de mediaan (mediaan is een betere schatting van de centrale tendens is dan het gemiddelde op een logaritmische schaal) van de positieve totdat het gelijk is aan de mediaan van de negatieven. Dit moet gebeuren voor elk van de fluorochroom labels gebruikt in het experiment. Om de mediaan, passen de spectrale overlap waarden hoger of lager totdat de medianen voor elke TL-parameter zo dicht mogelijk te maken. Compensatie kan ook automatisch worden gedaan met analyse software. Automatische compensatie maakt gebruik van de geregistreerde gegevens van de schadevergoeding regelt voor de berekening van een algebraïsche matrix voor alle fluoroforen gebruikt in het experiment. Deze waarden worden gebruikt om af te trekken uit de bijdragen van de niet-primaire kleuren die worden bloeden in detector een primaire kleur is. Noteer de experimentele monster worden gesorteerd en gebruik gating tools en subsetting methoden om de populaties van belang te definiëren. Stel de experimentele sjabloon met een dot plot dat FSC vs SSC displays en gebruik maken van een gating tool, veelhoek, rechthoek, interval of het kwadrant aan de poort van de bevolking van belang. De scatterplot geeft de fysische eigenschappen van de cel dat verschilt naar de cel type. De beste manier om de fluorescentie gating strategie te bepalen is het gebruik van fluorescentie minus een (FMO) controles. In een FMO-controle buis alle reagentia die worden gebruikt in het experiment zijn opgenomen, behalve voor de een van belang. De FMO helpt onderscheid te maken tussen zwak-lood bevolking en brede negatieve populaties. Gebruik maken van de gegevens opgenomen van FMO buizen om te bepalen waar hekken plaats binnen de experimentele buis. Zodra poorten zijn bepaald, kan de poorten worden geselecteerd voor het sorteren in de externe collectie buizen. Tot vier poorten (of populaties) kunnen worden gesorteerd in een keer, afhankelijk van de instrumentatie ter beschikking. Voer de experimentele monsterbuis bij 4 ° C, zet doorbuiging platen, en sorteren van het monster. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 cellen kunnen worden gesorteerd in een 12 x 75 mm buis en 1,5 x 10 6 – 4,5 x 10 6 cellen kunnen worden gesorteerd in een 15 ml conische. Zodra het vereiste aantal cellen is verkregen, handmatig stoppen sorteren. Voer een post-soort analyse om de zuiverheid van de gesorteerde celpopulaties bepalen. Representatieve resultaten We hebben hier aangetoond dat de uitkomsten voor muis milt B en CD4 T-cel sortering (figuur 1). Splenocyten werden gekleurd met PE Texas Red-geconjugeerd anti-muis-B220, FITC-geconjugeerd anti-muis-TCRβ en Alexafluor-700-geconjugeerd anti-muis-CD4 om B-cellen (B220 + TCRβ-) en CD4 T-cellen (CD4 + + TCRβ te identificeren ). Het sorteren werd uitgevoerd met BD FACS Aria instrument. Na het sorteren van de B-cel zuiverheid was> 97% en de CD4 T-cel zuiverheid was> 98%. Figuur 1. Zuiverheid van de milt B-cellen en CD4 T-cellen na FACS. Mouse splenocyten werden gekleurd met anti-muis B220, TCRβ en CD4 antilichamen. FACS voor de B-cellen werd uitgevoerd met behulp van een BD FACS Aria door gating op B220 + TCRβ-cellen (Fig. 1A, linker paneel, rechtsonder kwadrant). Een post sorteren analyse werd uitgevoerd om de zuiverheid van de B-cellen (Fig. 1A, rechter paneel) te bepalen. B220 kleuring is weergegeven op de x-as en TCRβ vlekken op de y-as. FACS voor de CD4 T-cellen werd uitgevoerd met behulp van dezelfde flowcytometer door gating op TCRβ + CD4 + cellen (Fig. 1B, linker paneel, rechtsboven kwadrant). Een post sorteren analyse werd uitgevoerd om de zuiverheid van de CD4 T-cellen (Fig. 1B, rechter paneel) te bepalen. TCRβ kleuring is weergegeven op de x-as en CD4 vlekken op de y-as. Het percentage positieve cellen in elk kwadrant wordt weergegeven. <!– Figuur 2. Zuiverheid van de milt CD4 T-cellen na FACS. Murine milt T-cellen werden verrijkt door de verwijdering van B-cellen door panning. Vervolgens werden de cellen gekleurd met anti-muis TCRβ en CD4 antilichaam (linker paneel). FACS werd uitgevoerd met behulp van een BD FACS Aria door gating op TCRβ + CD4 + cellen (linker paneel, rechts boven quadrmier). Een post sorteren analyse werd uitgevoerd om de zuiverheid van de T-cellen, die groter was dan 99% (rechter paneel) te bepalen. TCRβ kleuring is weergegeven op de x-as en CD4 vlekken op de y-as. Het percentage positieve cellen in elk kwadrant wordt weergegeven. ->

Discussion

FACS is een zeer geavanceerde techniek voor het zuiveren van cel populaties van belang, die een zeer hoge zuiverheid (95-100%) van de gesorteerde populatie kan worden verkregen. Daarom is deze techniek is vooral van belang voor experimenten, waar hoge zuiverheid is een essentiële vereiste (bijv. microarray analyse). FACS is bijzonder gunstig ten opzichte van andere beschikbare methoden van zuivering wanneer een cel bevolking moet gezuiverd worden op basis van een wekelijkse uitgedrukt oppervlak marker of wanneer twee of meer bevolkingsgroepen moeten worden gezuiverd die verschillende niveaus van expressie van hetzelfde oppervlak marker te hebben. Bijvoorbeeld, de zuivering van marginale zone B cellen (B220 ⁺ CD21 CD23 ^{hi int / laag)} en folliculair B-cellen (B220 ⁺ CD21 ^{int / lage} CD23 ^hi) op basis van expressie van CD21 en CD23. Een andere groeiende toepassing van FACS is single cell sorting waardoor de analyse van individuele cellen (3, 4). FACS wordt ook vaak gebruikt om te sorteren cellen die fluorescerende eiwitten die genetisch worden uitgedrukt, zoals groen fluorescerend proteïne gemerkte eiwitten (5). Als een soort steriele wordt uitgevoerd van de cellen kunnen worden gekweekt. Kunnen echter levensvatbaarheid van de cellen en de opbrengst in het gedrang komen tijdens het sorteren. Levensvatbaarheid kan worden verbeterd door gebruik te maken van een cel-afhankelijke optimale temperatuur voor het sorteren en door het verwerken verzameling buizen direct na het bereiken van de capaciteit. Herstel kan worden verhoogd door gebruik te maken polypropyleen verzameling buizen, het verzamelen van gesorteerd cellen in serum rich media en om te keren verzameling buizen met tussenpozen, het onderhouden collectie buizen op een optimale temperatuur en centrifugeren gesorteerde cellen voor ~ 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm).

De ontwikkeling van ultra high-speed sorteerders heeft uitgebreid de mogelijkheid van de toepassing van de stroming sorteren in klinische settings. De potentiële klinische toepassingen van FACS onder andere zuivering van het bloed stamcellen uit menselijk bloed voor therapeutische doeleinden, toepassingen in de behandeling van kanker, vruchtwaterpunctie vervanging, sorteren menselijk sperma en het begin van de ziekte detecties (6, 7).

Voor multicolor kleuring, antilichaam selectie is een cruciale stap en fluorochromen zijn gekozen op basis van het detectiesysteem voor elk specifiek instrument. Er zijn een aantal bedrijven die cel sorteerders en de laser configuratie varieert verkopen op basis van behoeften van de gebruiker. Zo kan men niet gewoon gebruik maken van exact dezelfde antilichamen gebruikt in de gepubliceerde studies zonder te bevestigen compatibiliteit. Voor een optimale antilichaam selectie, moet men rekening houden met de expressie van het eiwit wordt onderzocht. In het algemeen moet de helderste beschikbare fluorochroom-gelabelde antilichamen worden gebruikt om slecht uitgedrukt oppervlakte markers vlek, terwijl de dim fluorochromen kan worden gebruikt voor de kleuring van hoog tot expressie oppervlakte markers (8). Daarnaast, antistoffen worden geselecteerd op een zodanige wijze dat de overlap tussen hun emissie-spectra is minimaal. Voor multicolor vlekken, is het uiterst moeilijk om te kiezen fluorochroom die geen spectrale overlap. In deze situatie, is compensatie uitgevoerd.

Compensatie is nodig om mathematisch te elimineren de fluorescentie overlap tussen de emissie spectrum van de verschillende fluorochromen dat is meetbaar door de detectoren (8-10). Met andere woorden, is de overlap fluorescentie van een fluorochroom afgetrokken van de emissie spectrum van een ander fluorchroom. De vergoeding berekening vereist een onbevlekte controle en een positieve controle voor elk fluorochroom gebruikt voor een multicolor kleuren (9, 10). Compensatie kan worden uitgevoerd met behulp van cellen of kralen. De parels zijn gemakkelijk te vlek, hebben een robuust signaal en bieden een eenvoudige manier te bereiden enkele gekleurde controles die de dezelfde fluoroforen als de experimentele monsters. Compensatie kralen zijn bijzonder voordelig wanneer de cel oppervlakte-eiwit van interesse is geuit op een laag niveau en wanneer de cel bevolking van belang is beperkt in de eerste start celpopulatie.

Nadat de antilichamen zijn gekozen, hun activiteiten moeten worden geoptimaliseerd door het uitvoeren van een titratie analyse. Dit is vooral belangrijk als de FACS apparaat heeft zeer krachtige lasers. Het gebruik van suboptimale concentraties van vlekken antistoffen kunnen leiden tot slechte scheiding van de gewenste cel populatie van de totale celpopulatie. Het gebruik van hoge concentraties antistoffen verhoogt de kans voor antigeen niet-specifieke kleuring. Daarom titratie van antilichamen zal de selectie van het antilichaam concentratie dat de maximale helderheid van het positieve populatie en minimale achtergrondkleuring (8) geeft.

FACS is nu een standaard techniek voor de zuivering van subpopulaties van cellen. Het kan worden gebruikt om elke celtype waarin een enkele cel suspensie kan worden gegenereerd en antistoffen zijn beschikbaar om de gewenste cel populatie te scheiden. FACS is de methode van keuze wanneer highly zuivere celpopulaties zijn vereist.