Immunology and Infection

La purificación de la población de células específicas de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS)

Published: July 10, 2010 doi: 10.3791/1546

Sreemanti Basu¹, Hope M. Campbell¹, Bonnie N. Dittel¹, Avijit Ray¹

¹Blood Research Institute, BloodCenter of Wisconsin

Summary

Para muchos estudios científicos que requieren un análisis biológico y químico de las poblaciones celulares de las células deben estar en un alto estado de pureza. Fluorescencia de clasificación de células activadas (FACS) es un método superior en el que para obtener poblaciones puras de células.

Abstract

Los estudios experimentales y clínicos a menudo requieren altamente purificado poblaciones de células. FACS es una técnica de elección para purificar las poblaciones de células de fenotipo conocido. Otros métodos incluyen la mayor parte de la purificación panorama, el agotamiento del complemento y la separación de esferas magnéticas. Sin embargo, FACS tiene varias ventajas sobre otros métodos disponibles. FACS es el método preferido cuando de muy alta pureza de la población deseada es necesario, cuando la población de células diana expresa un nivel muy bajo de la marca de identificación o cuando las poblaciones de células requieren la separación basada en la densidad diferencial marcador. Además, FACS es la única técnica de purificación para aislar las células basadas en la tinción interna o la expresión de proteínas intracelulares, como un marcador de proteína modificada genéticamente fluorescente. FACS permite la purificación de las células individuales en función del tamaño, la granularidad y de fluorescencia. Con el fin de purificar las células de interés, que primero se tiñeron con fluorescente marcada con anticuerpos monoclonales (mAb), que reconocen los marcadores específicos de superficie en la población celular deseada (1). Selección negativa de células no teñidas también es posible. Purificación FACS requiere un citómetro de flujo con la clasificación de la capacidad y el software adecuado. Por FACS, células en suspensión se transmiten como un flujo de gotas de cada uno con una sola célula en frente de un láser. El sistema de detección de fluorescencia detecta las células de interés en base a parámetros predeterminados fluorescentes de las células. El instrumento se aplica una carga a la gota que contiene una célula de interés y un sistema de deflexión electrostática facilita la recolección de las gotitas cargadas en tubos de recogida adecuado (2). El éxito de la tinción y la clasificación por lo tanto depende en gran medida la selección de los marcadores de la identificación y la elección del MAB. Parámetros de clasificación se puede ajustar dependiendo de la exigencia de pureza y rendimiento. Aunque FACS requiere equipo especializado y la capacitación del personal, es el método de elección para el aislamiento de las poblaciones altamente purificada de células.

Protocol

Antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados:
1. Hielo
2. Tubos de 15 ml cónicos de tinción de las células y de 12 x 75 mm tubos de flujo para la tinción de los controles de un solo color.
3. Tinción de amortiguación: tampón fosfato salino (PBS) + 3% de suero fetal bovino (FCS)
4. Pipetas
5. Fc bloque (si es necesario) y los anticuerpos tinción. Anticuerpos necesidad de ser valorados para la tinción óptima.
6. Cuentas de compensación
7. Amortiguación de la suspensión: solución salina equilibrada de Hank (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% de FCS
8. Azul de tripano y hemocitómetro
9. Células colador (40 m de nylon)
10. Tubos de recogida: Hay dos tipos de tubos de recolección se puede utilizar a) 12 x 75 mm tubos de poliestireno (que contiene 300 l FCS y HEPES 25 mM) o b) tubos de 15 ml cónicos (que contiene 1 ml de FCS + HEPES 25 mM). Cualquier medio rico con la concentración sérica alta se puede utilizar para la recolección de células seleccionadas.
Generar una suspensión de células individuales de la población de células de partida.
Opcional: para enriquecer la población celular deseada por un método de purificación a granel, tales como el agotamiento de complementar o clasificación magnética. La principal ventaja de la etapa de enriquecimiento es que reduce el tiempo de clase.
Lave las células una vez con buffer de tinción.
Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en buffer de tinción en una concentración de hasta 50 x 10 ⁶ para la tinción eficiente.
Opcional: Para las células que expresan altos niveles de FcR, bloquean los receptores con un método apropiado de bloqueo. Un método de elección es el uso de un mAb que se une a FcγR en hielo durante 10-15 min. Estos anticuerpos se encuentran disponibles comercialmente.
Añada la MAB (a una concentración predeterminada) para teñir la población celular deseada e incubar durante 20-30 minutos sobre el hielo en la oscuridad, seguido de dos lavados con buffer de tinción. Opcional: La tinción con un colorante vital, como el yoduro de propidio, se pueden incluir para distinguir las células muertas (5). Si multi-color de tinción se va a utilizar, los controles de un solo color son obligatorios. Usamos CompBeads BD para preparar los controles de un solo color con el protocolo del fabricante.
Si no se utiliza directamente los anticuerpos conjugados, repita el paso 7, utilizando el anticuerpo secundaria apropiada o conjugado estreptavidina.
Después del lavado, resuspender las células en medio de cultivo y determinar la concentración de células usando un colorante vital como el azul tripán.
Ajustar la concentración de células a 15-20 x 10 ⁶ / ml. Para las poblaciones de células que forman grupos, que pueden obstruir el instrumento durante la clasificación, el filtro de las células a través de un colador.
Configurar y optimizar el clasificador de células. El proceso de creación de un citómetro de flujo es muy variada dependiendo de la fabricación y debe ser realizada por personal debidamente capacitado.
Las recomendaciones generales son las siguientes:
1. Seleccione la boquilla adecuada dependiendo del tipo de célula para realizar la clasificación.
2. Para las clases estériles, esterilizar el instrumento.
3. Realizar el control de instrumentos de calidad con cuentas para verificar los láseres están funcionando, y es clasificar con precisión.
4. Instalar el dispositivo de recogida necesarios y establecer las corrientes laterales.
5. Mira láser del instrumento y detector establecida para la determinación de las etiquetas fluorescentes que se pueden utilizar (nuestra BD FACS Aria dispone de tres láseres y puede detectar hasta nueve colores).
6. Una vez que se determina lo que las etiquetas fluorescentes se utilizan en el clasificador de células, la compensación puede llevarse a cabo (como se explica más adelante).
Realizar la compensación con la muestra de control negativo y los controles positivos solo. La compensación es necesaria para eliminar la superposición de espectro entre los dos detectores. Es pertinente señalar que la indemnización no es a toda prueba y se ve afectada por el brillo con marcadores de ciertas manchas, y por la fluorescencia de las células que han autofluorescencia bajo, lo que puede conducir a la resolución entre las poblaciones pobres oscuro y negativo.
Para mejores resultados, el diseño experimental debe incluir el uso de fluorocromos brillante con marcas que tienen una expresión baja o que no tienen un patrón de tinción conocido. Marcadores que proporcionan una buena separación entre las poblaciones de células y son altamente expresado debe ser utilizado con fluorocromos como el dímero excitado por los rayos láser de color rojo o violeta.
1. La compensación puede ser realizada con cuentas de compensación, que son micropartículas de poliestireno que se han unido a un anticuerpo específico para la cadena ligera Kappa de Ig de ratón, la rata o ratón / hamster. Las cuentas son fáciles de mancha, tienen una potente señal y proporcionar una manera fácil de preparar un solo control que han manchado el fluoróforo igual que las muestras experimentales.
2. Configurar una plantilla que incluye una parcela para mostrar dos variables de dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC), y el histograma de unacada fluorocromo que se utilizará.
3. Ejecute el tubo de control negativo y ajustar la dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para colocar a la población de interés en la escala.
4. Ajustar la configuración del PMT de fluorescencia para colocar el negativo de la población o autofluorescencia en la parte de la extrema izquierda del histograma.
5. Registre el tubo de control negativo.
6. Ejecutar los tubos de una sola positiva controlar y registrar los datos de cada tubo.
7. Dibuja una puerta de intervalo alrededor de la parte positiva de los datos en el histograma, y otra puerta de intervalo en la parte negativa del histograma.
8. Compensación manual se realiza mediante el ajuste de la mediana (la mediana es una mejor estimación de la tendencia central que la media en una escala logarítmica) de los positivos hasta que sea igual a la mediana de los negativos. Esto debe hacerse para cada una de las etiquetas fluorocromo utilizado en el experimento.
9. Para ajustar la mediana, ajustar los valores de solapamiento espectral superior o inferior hasta las medianas para cada partido de parámetros fluorescentes de la medida de lo posible.
10. La compensación también se puede hacer automáticamente con el software de análisis. Compensación automática utiliza los datos registrados en los controles de compensación para el cálculo de una matriz algebraica de todos los fluoróforos utilizados en el experimento. Estos valores se utilizan para sustraer las contribuciones de los colores no primarios que están sangrando al detector de un color primario.
Registro de la muestra experimental a ordenar y utilizar las herramientas y los métodos de gating subconjuntos para definir las poblaciones de interés.
1. Configurar la plantilla experimental con un gráfico de puntos que muestra FSC frente a SSC y el uso de una herramienta de activación de puertas, polígono, rectángulo, intervalo o cuadrante de la puerta de la población de interés. El diagrama de dispersión muestra las propiedades físicas de la célula que es distinto del tipo de células.
2. La mejor manera de determinar la estrategia de gating fluorescencia es el uso de la fluorescencia menos uno de control (FMO). En un tubo de control de FMO todos los reactivos que se utilizan en el experimento se incluyen a excepción de la que le interese. La FMO ayuda a discriminar entre las poblaciones con poca colores y amplia las poblaciones negativas.
3. Utilicen los datos registrados a partir de tubos de FMO para determinar dónde colocar compuertas en el tubo experimental.
Una vez que las puertas se han determinado, las puertas pueden ser seleccionados para la clasificación en los tubos de recolección externa. Un máximo de cuatro puertas (o poblaciones) pueden ser ordenados en un momento en función de los instrumentos disponibles.
Ejecute el tubo de la muestra experimental a 4 ° C, a su vez en las placas de desviación, y ordenar la muestra. 5 x 10 ⁵ -1,5 x 10 ⁶ células se pueden clasificar en un tubo de 12 x 75 mm y 1,5 x 10 ⁶ - 4.5 x 10 ⁶ células se pueden clasificar en un matraz cónico de 15.
Una vez que el número necesario de células se ha obtenido, detener manualmente la clasificación.
Realizar un análisis post-tipo para determinar la pureza de las poblaciones de células ordenados.

Los resultados representativos

Hemos demostrado aquí los resultados de B de ratón esplénica y T CD4 clasificación de células (Figura 1). Esplenocitos fueron teñidas con PE Texas Red-conjugado anti-ratón B220, conjugado con FITC anti-ratón TCRβ y AlexaFluor-700-conjugado anti-ratón CD4 para identificar a las células B (B220 + TCRβ) y células T CD4 (CD4 + TCRβ + ). La clasificación se realizó con BD FACS Aria instrumento. Después de la clasificación de la pureza de las células B fue> 97% y la pureza de células CD4 T era> 98%.

Figura 1. Pureza de las células B del bazo y las células T CD4 después de FACS. Esplenocitos de ratón se tiñeron con B220 anti-ratón, TCRβ y anticuerpos CD4. FACS de las células B se realizó con un BD FACS Aria por gating en B220 + TCRβ las células (Fig. 1A, panel izquierdo, cuadrante inferior derecho). Un análisis de clase después se realizó para determinar la pureza de las células B (Fig. 1A, panel derecho). Tinción B220 se muestra en el eje X y la tinción TCRβ en el eje. FACS de las células T CD4 se realizó con el mismo citómetro de flujo por gating en TCRβ + células CD4 + (Fig. 1B, panel izquierdo, cuadrante superior derecho). Un análisis de clase después se realizó para determinar la pureza de las células T CD4 (Fig. 1B, panel derecho). Tinción TCRβ se muestra en el eje X y CD4 manchas en el eje. El porcentaje de células positivas en cada cuadrante se muestra.