טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

Summary

עבור מחקרים מדעיים רבים הדורשים ניתוח ביולוגי וכימי של אוכלוסיות תאים תאים חייב להיות במצב גבוה של טוהר. תא Fluorescence מיון מופעל (FACS) היא שיטה מעולה בו כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהור.

Abstract

מחקרים ניסיוניים וקליניים לעיתים קרובות דורשים מטוהרים מאוד אוכלוסיות תאים. FACS היא טכניקה של בחירה כדי לטהר אוכלוסיות תאים של פנוטיפ ידוע. עיקר שיטות אחרות של טיהור כוללות צילום פנורמי, דלדול להשלים חרוז הפרדה מגנטי. עם זאת, FACS יש מספר יתרונות על פני השיטות הזמינות האחרות. FACS היא השיטה המועדפת כאשר הטוהר גבוהה מאוד של האוכלוסייה הרצויה נדרשת, כאשר האוכלוסייה תא היעד מבטא רמה נמוכה מאוד של הסמן, או כאשר זיהוי אוכלוסיות תאים דורשים הפרדה על בסיס צפיפות סמן ההפרש. בנוסף, FACS היא הטכניקה רק טיהור זמין לבודד תאים בהתבסס על מכתים פנימי או ביטוי חלבונים תאיים, כגון סמן מהונדסים גנטית חלבון פלואורסצנטי. FACS מאפשרת טיהור של תאים בודדים גרעיניות על בסיס גודל, פלואורסצנטי. על מנת לטהר את התאים של עניין, הם מוכתמים הראשון עם fluorescently-tagged נוגדנים חד שבטיים (מב), אשר מזהה סמנים ספציפיים על פני האוכלוסייה התא הרצוי (1). סלקציה שלילית של תאים בלא כתם הוא גם אפשרי. טיהור FACS דורש cytometer לזרום עם מיון קיבולת התוכנה המתאים. עבור FACS, תאים ההשעיה מועברים כזרם בטיפות עם שכל אחת מהן מכילה תא בודד מול לייזר. מערכת גילוי הקרינה מזהה תאים של עניין על פי פרמטרים שנקבעו מראש ניאון של התאים. מכשיר חל חיוב אגל המכיל תא עניין ומערכת סטיה אלקטרוסטטי מקלה אוסף של טיפות טעון לתוך צינורות איסוף המתאים (2). ההצלחה של מכתים ובכך מיון תלוי במידה רבה על הבחירה של סמנים לזיהוי הבחירה של MAB. פרמטרים של מיון יכול להיות מותאם בהתאם לדרישה של טוהר ואת התשואה. למרות FACS דורש ציוד מיוחד והכשרה אדם, היא שיטת הבחירה של בידוד מטוהרים מאוד אוכלוסיות תאים.

Protocol

לפני שמתחילים את התהליך, את הפריטים הבאים צריכים להיות מוכנים אסף: קרח 15 צינורות חרוטי מ"ל עבור תאים מכתים ו 12 x 75 מ"מ עבור זרימת צינורות מכתים צבע שולט יחיד. מכתים חיץ: פוספט בופר סליין (PBS) + 3% עוברית עגל בסרום (FCS) Pipettes Fc לחסום (אם נדרש) ונוגדנים מכתים. נוגדנים צריך להיות טיטרציה עבור מכתים אופטימלית. פיצוי חרוזים חיץ השעיה: תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS Trypan כחול hemocytometer תא מסננת (40 ניילון מיקרומטר) אוסף צינורות: שני סוגים של צינורות איסוף ניתן להשתמש א) 12 x 75 מ"מ צינורות פוליסטירן (המכיל 300 FCS μl ו HEPES 25 מ"מ) או ב) 15 מ"ל צינורות חרוטי (המכיל 1 + 25 מ"ל FCS HEPES mM). כל מדיום עשיר עם ריכוז בסרום גבוהה יכול לשמש אוסף של תאים ממוינים. צור השעיה תא בודד של האוכלוסייה תא ההתחלה. אופציונלי: להעשיר לאוכלוסייה התא הרצוי על ידי שיטה לטיהור בתפזורת כגון דלדול משלימים או מיון מגנטי. היתרון העיקרי של צעד ההעשרה היא שזה מפחית את זמן המיון. שטפי פעם עם תאים מכתים חיץ. בטל supernatant ו resuspend התאים מכתים חיץ בריכוז של עד 50 x 10 6 עבור מכתים יעיל. אופציונלי: עבור תאים להביע רמות גבוהות של FCR, לחסום את הקולטנים באמצעות שיטה חסימת המתאים. שיטת הבחירה היא השימוש MAB הנקשרת FcγR על קרח למשך 10-15 דקות. נוגדנים אלה זמינים מסחרית. מוסיפים את מב המתאים (בריכוז קבוע מראש) להכתים את אוכלוסיית התאים הרצויים דגירה של 20-30 דקות על הקרח בחושך, ואחריו שני שוטף עם חיץ מכתים. אופציונלי: צביעה עם צבע חיוניים, כגון יודיד propidium, ניתן לכלול להבחין תאים מתים (5). אם צבע רב מכתים היא לשמש, צבע שולט יחיד נדרשים. אנו משתמשים CompBeads BD להכין צבע שולט יחיד באמצעות פרוטוקול של היצרן. אם לא באמצעות נוגדנים מצומדות ישירות, חזור על שלב 7 באמצעות נוגדנים משני מתאים או המצומד streptavidin. לאחר כביסה, resuspend התאים בינוני תרבות לקבוע את ריכוז התאים בעזרת צבע חיוניים כגון Trypan כחול. התאם את הריכוז התא 15-20 x 10 6 / ml. לגבי אוכלוסיות תא אשכולות טופס, אשר עלול להדביק את המכשיר במהלך מיון, סינון התאים דרך מסננת. הגדרת לייעל את סדרן התא. תהליך הגדרת זרימה cytometer מגוונת בהתאם בייצור צריך להיות מבוצע על ידי צוות מיומן כראוי. המלצות כלליות הן כדלקמן: בחר את זרבובית המתאים בהתאם לסוג התא להיות מסודר. במשך מיני סטרילי, לעקר את המכשיר. ביצוע בקרת איכות מכשיר עם חרוזים לאמת לייזרים מתפקדים, והוא מיון במדויק. התקנת המכשיר אוסף נדרש להגדיר את הזרמים בצד. תראו לייזר של המכשיר גלאי להגדיר כדי לקבוע את תוויות ניאון כי ניתן להשתמש (BD שלנו FACS Aria יש שלושה לייזרים יכול לזהות עד תשעה צבעים). ברגע שזה נקבע מה תוויות ניאון ישמש על סדרן התא, הפיצוי ניתן לבצע (כפי שמוסבר בהמשך). בצע פיצוי באמצעות מדגם שליטה שלילית שולטת חיובית אחת. פיצויים יש צורך להסיר את ספקטרום חפיפה בין שני הגלאים. זה רלוונטי לציין פיצוי שאינו טיפש הוכחה והוא מושפע לרעה כמה סמנים מסוימים כתם בהיר, ועל ידי הקרינה של תאים בעלי autofluorescence נמוך אשר יכול להוביל ברזולוציה נמוכה בין אוכלוסיות עמום שלילית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, העיצוב הניסוי יכלול שימוש fluorochromes בהיר עם סמנים כי יש ביטוי נמוך או שאין להם דפוס מכתים ידוע. סמנים המספקים הפרדה טובה בין אוכלוסיות תאים באים לידי ביטוי מאוד להשתמש עם דימר fluorochromes כגון אלה נרגש לייזרים אדום או סגול. הפיצוי ניתן לבצע עם חרוזים פיצויים, אשר microparticles קלקר, כי כבר מצמידים את נוגדן ספציפי שרשרת האור של איג קאפה מתוך עכבר, חולדה, או חולדה / אוגר. החרוזים קל כתם, יש אות חזקים מספקים דרך קלה להכנת שולטת מוכתם יחיד כי יש fluorophore זהה דגימות הניסוי. הגדרת תבנית הכוללת עלילה bivariate לתצוגה פיזור קדימה (FSC) ולפזר צד (SSC), ואחד היסטוגרמה עבורכל fluorochrome אשר ישמשו. הפעל את שפופרת שליטה שלילי ולהתאים את פיזור קדימה (FSC) ולפזר לוואי (SSC) למקום אוכלוסייה של הריבית על קנה מידה. התאם את ההגדרות PMT הקרינה למקום האוכלוסייה autofluorescence שלילי או בחלק השמאלי המרוחק של ההיסטוגרמה. הקלט את שפופרת שליטה שלילית. הפעל את צינורות יחיד מלאה חיובי ולהקליט את הנתונים עבור כל צינור. ציור השער המרווח סביב החלק החיובי של נתוני היסטוגרמה, ועוד שער מרווח על החלק השלילי של ההיסטוגרמה. הפיצוי נעשה באופן ידני על ידי התאמת הממוצע (חציון הוא להעריך טוב יותר את הנטייה המרכזית מאשר הממוצע בסולם לוגריתמי) של תוצאות חיוביות עד שהוא שווה לחציון של הדברים השליליים. זה חייב להיעשות עבור כל התוויות fluorochrome השתמשו בניסוי. כדי להתאים את החציון, להתאים את הערכים חפיפה ספקטרלית או גבוה או נמוך עד חציונים עבור כל משחק פרמטר פלורסנט ככל האפשר. הפיצוי יכול להיעשות גם באופן אוטומטי עם תוכנת ניתוח. פיצוי אוטומטי משתמשת בנתונים רשמה שולטת פיצוי לחשב מטריצה ​​אלגברית לכל fluorophores השתמשו בניסוי. ערכים אלה משמשים כדי להפחית את התרומות הלא העיקרי צבעים דימום לתוך גלאי של צבע ראשוני. הקלט את מדגם ניסיוני להיות מסודר ולהשתמש בכלים gating ושיטות subsetting להגדיר את האוכלוסיות של עניין. הגדרת תבנית ניסיונית עם עלילה נקודה המציג FSC מול SSC ו להשתמש בכלי gating, מצולע, מלבן, רווח או ברבע לשער האוכלוסייה של עניין. העלילה פיזור מציג את המאפיינים הפיזיים של התא אשר ברורים לסוג התא. הדרך הטובה ביותר לקבוע את אסטרטגיית gating הקרינה היא להשתמש פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) שולטת. בתוך שפופרת מלאה FMO ריאגנטים כל המשמשים בניסוי כלולים למעט עניין אחד. FMO מסייע להבחין בין אוכלוסיות מוכתם במעומעם אוכלוסיות שלילית רחבה. השתמש נתונים רשמה צינורות FMO כדי לקבוע היכן למקם את השערים בתוך שפופרת הניסוי. לאחר השערים נקבעו, השערים ניתן לבחור למיון לתוך צינורות איסוף חיצוני. עד ארבעה שערים (או אוכלוסיות) ניתן למיין בבת אחת בהתאם המכשור זמין. הפעל את שפופרת מדגם ניסיוני 4 ° C, להפעיל צלחות סטיה, ולמיין את המדגם. 5 x 10 x 10 5 -1.5 6 תאים ניתן למיין לתוך צינור 12 מ"מ ו 75 x 1.5 x 10 6-4.5 x 10 6 תאים ניתן למיין לתוך 15 מ"ל חרוטי. לאחר מספר נדרש של תאים התקבל, באופן ידני להפסיק מיון. לבצע ניתוח שלאחר מיון כדי לקבוע את הטוהר של אוכלוסיות תאים ממוינים. נציג תוצאות הראינו כאן תוצאות עבור B עכבר הטחול ואת תא T מסוג CD4 מיון (איור 1). Splenocytes הוכתמו PE טקסס אדום מצומדות אנטי עכבר B220 TCRβ, אנטי עכבר FITC-מצומדות ו Alexafluor-700-מצומדות אנטי עכבר CD4 כדי לזהות תאים B (B220-TCRβ +) ו-T מסוג CD4 תאים (CD4 + + TCRβ ). מיון בוצעה עם מכשיר BD Aria FACS. לאחר מיון על טוהר תא B היה> 97% ואת תא טוהר T מסוג CD4 היה> 98%. באיור 1. טוהר של תאים B ו-T מסוג CD4 הטחול תאים לאחר FACS. Splenocytes עכבר הוכתמו עכבר אנטי, TCRβ B220 ו נוגדנים CD4. עבור תאים ב FACS בוצעה באמצעות FACS BD Aria gating על ידי B220 + TCRβ תאים (איור 1 א ', הפאנל השמאלי, ברבע הימני התחתון). ניתוח מין הודעה בוצע על מנת לקבוע את הטוהר של תאים B (איור 1 א ', הפאנל מימין). מכתים B220 מוצג על ציר ה-x ו מכתים TCRβ על ציר ה-Y. FACS עבור תאים מסוג CD4 T בוצעה באמצעות cytometer תזרים אותו על ידי gating על TCRβ + CD4 + תאים (איור 1B, הפאנל השמאלי, ברבע הימני העליון). ניתוח מין הודעה בוצע על מנת לקבוע את הטוהר של תאים מסוג CD4 T (איור 1B, פאנל מימין). מכתים TCRβ מוצגת על ציר ה-x ו CD4 מכתים על ציר ה-Y. התאים אחוז חיובי ברבע כל מוצג. <!– איור 2. טוהר CD4 ותאי T הטחול לאחר FACS. Murine בתאי T הטחול היו מועשר על ידי הסרת תאים B על ידי panning. כתוצאה מכך, התאים היו מוכתמות אנטי עכבר TCRβ ו CD4 נוגדן (הפאנל השמאלי). FACS בוצעה באמצעות FACS BD gating על ידי Aria TCRβ + CD4 + תאים (הפאנל השמאלי, quadr הימנית העליונהנמלה). ניתוח מין הודעה בוצע על מנת לקבוע את הטוהר של ותאי T, אשר היה גדול מ 99% (פאנל מימין). מכתים TCRβ מוצגת על ציר ה-x ו CD4 מכתים על ציר ה-Y. התאים אחוז חיובי ברבע כל מוצג. ->

Discussion

FACS היא טכניקה מתוחכמת ביותר לטיהור אוכלוסיות תאים בעלי עניין, שבה הטוהר גבוהה מאוד (95-100%) של האוכלוסייה מיון ניתן להשיג. לכן, טכניקה זו היא חשובה במיוחד עבור ניסויים, שבהם טוהר גבוהה היא תנאי הכרחי (למשל ניתוח microarray). FACS יתרון במיוחד על השיטות הזמינות האחרות של טיהור, כאשר האוכלוסייה התא צריך להיות מטוהרים מבוסס על סמן משטח השבועית הביע או כאשר שניים או יותר אוכלוסיות צריכים להיות מטוהרים אשר יש רמות שונות של ביטוי סמן את פני השטח אותו. לדוגמה, טיהור אזור שוליים B תאים (B220 ⁺ CD21 CD23 ^{היי int / נמוך)} ו-B פוליקולרית תאים (B220 ⁺ CD21 ^{int / נמוך היי} CD23) בהתבסס על רמות ביטוי של CD21 ו – CD23. יישום נוסף הוא גדל והולך של FACS מיון תא יחיד ומאפשר ניתוח של תאים בודדים (3, 4). FACS הוא גם נפוץ בתאי מין הבעת חלבוני ניאון כי הם הביעו גנטית, כגון חלבונים חלבון פלואורסצנטי ירוק מתויג (5). אם מעין סטרילי מתבצע התאים יכול להיות מתורבת. עם זאת, כדאיות התא ואת התשואה אפשר להתפשר במהלך המיון. הכדאיות ניתן לשפר באמצעות תא תלויי טמפרטורה אופטימלית למיון ועל ידי צינורות עיבוד אוסף מיד אחרי שהם מגיעים קיבולת. השחזור ניתן להגדיל באמצעות אוסף צינורות פוליפרופילן, איסוף תאים ממוינים מדיה עשירה בסרום וצינורות אוסף היפוך לסירוגין, שמירה על צינורות אוסף בטמפרטורה אופטימלית centrifuging תאים ממוינים דקות 10 ~ (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm).

הפיתוח של מהירות גבוהה במיוחד sorters האריך את האפשרות של יישום של מיון תזרים במסגרות קליניות. יישומים קליניים הפוטנציאל של FACS כוללים טיהור בתאי גזע של דם דם אדם למטרות טיפוליות, יישומים בטיפול בסרטן, החלפת בדיקת מי שפיר, מיון זרע אנושי לתגליות המחלה מוקדם (6, 7).

עבור מכתים ססגוניות, מבחר נוגדן היא צעד קריטי fluorochromes נבחרים מבוסס על מערכת זיהוי כל מכשיר מסוים. ישנן מספר חברות שמוכרות sorters התא התצורה לייזר משתנה לפי צרכי המשתמש. לכן אי אפשר פשוט להשתמש נוגדנים בדיוק משמש מחקרים שפורסמו ללא אישור תאימות. עבור מבחר נוגדן אופטימלי, יש לשקול את רמת הביטוי של החלבון הנבדק. באופן כללי, נוגדנים הבהיר fluorochrome-tagged זמין צריך לשמש כתם סמנים השטח לידי ביטוי עמום, בעוד fluorochromes עמום יכול לשמש מכתים את פני השטח של סמנים הביע ביותר (8). בנוסף, נוגדנים יש לבחור בצורה כזאת, כי חפיפה בין ספקטרום הפליטה שלהם היא מינימלית. עבור מכתים ססגוניות, קשה מאוד לבחור fluorochrome כי אין חפיפה ספקטרלית. במצב זה, פיצוי מבוצע.

פיצויים יש צורך לחסל את מתמטית חפיפה בין ספקטרום הקרינה את פליטות של fluorochromes שונים זה שניתן לכמת ידי גלאי (80-10). במילים אחרות, חופפים את הקרינה מאחד fluorochrome מופחת ספקטרום פליטת אחר fluorochrome. חישוב הפיצוי דורש שליטה בלא כתם בקרות חיובי יחיד לכל fluorochrome המשמש מכתים ססגוניות (9, 10). הפיצוי ניתן לבצע באמצעות תאים או חרוזים. החרוזים קל כתם, יש אות חזקים מספקים דרך קלה להכנת שולטת מוכתם יחיד כי יש fluorophores זהה דגימות הניסוי. חרוזים פיצויים הם יתרון במיוחד כאשר שטח פני התא חלבון עניין מתבטאת ברמה נמוכה וכאשר אוכלוסיית תאים של הריבית הגבלת באוכלוסייה התא הראשוני ההתחלה.

לאחר נוגדנים נבחרו, הפעילות שלהם צריך להיות מותאם על ידי ביצוע ניתוח טיטרציה. הדבר חשוב במיוחד אם המכשיר FACS יש לייזרים רבי עוצמה ביותר. השימוש בריכוזים הכי מוצלח של נוגדנים מכתים יכול לגרום ההפרדה עניים האוכלוסייה התא הרצוי מתוך האוכלוסייה תא מוחלט. השימוש ריכוזי נוגדנים גבוה מגביר את הסיכוי מכתים אנטיגן בלתי ספציפי. לכן טיטרציה נוגדן יאפשר את הבחירה של ריכוז הנוגדנים שנותן בהירות מקסימלית של האוכלוסייה חיובית מכתים רקע מינימלי (8).

FACS עכשיו היא טכניקה תקן לטיהור של subpopulations של תאים. זה יכול לשמש כדי להפריד כל סוג התא שבו ההשעיה תא בודד ניתן להפיק נוגדנים זמינים כדי לזהות את האוכלוסייה התא הרצוי. FACS היא השיטה של ​​בחירה כאשר highly אוכלוסיות תאים טהור נדרשים.