Pour de nombreuses études scientifiques nécessitant une analyse biologique et chimique des populations de cellules, les cellules doivent être dans un état de pureté élevé. Fluorescence tri cellulaire (FACS) est une méthode supérieure dans laquelle d'obtenir des populations de cellules pures.
Des études expérimentales et cliniques ont souvent besoin hautement purifiée populations de cellules. FACS est une technique de choix pour purifier les populations de cellules de phénotype connu. Autres méthodes de purification en vrac comprennent panoramique déplétion complément, et séparation magnétique perle. Toutefois, FACS a plusieurs avantages sur les autres méthodes disponibles. FACS est la méthode préférée quand une pureté très élevée de la population désirée est nécessaire, lorsque la population de cellules cibles exprime un niveau très bas du marqueur identifiant ou lorsque les populations de cellules nécessitent une séparation basée sur la densité de marqueur différentiel. En outre, FACS est la seule technique de purification disponibles pour isoler les cellules basées sur la coloration interne ou l'expression des protéines intracellulaires, comme un marqueur fluorescent protein génétiquement modifiés. FACS permet la purification des cellules individuelles basées sur la taille, la granularité et la fluorescence. Afin de purifier les cellules d'intérêt, ils sont d'abord colorées par fluorescence marqués d'anticorps monoclonaux (mAb), qui reconnaissent des marqueurs de surface spécifiques sur la population de cellules désirée (1). La sélection négative des cellules non colorées est également possible. Purification de FACS nécessite un cytomètre en flux avec tri des capacités et le logiciel approprié. Pour FACS, les cellules en suspension sont transmises comme un flux de gouttelettes avec chacun contenant une seule cellule en face d'un laser. Le système de détection par fluorescence détecte les cellules d'intérêt basé sur des paramètres prédéterminés fluorescents des cellules. L'instrument applique une charge à la goutte contenant une cellule d'intérêt et d'un système de déflexion électrostatique facilite la collecte des gouttelettes chargées dans des tubes de collecte approprié (2). Le succès de la coloration et de ce fait le tri dépend largement de la sélection des marqueurs d'identification et le choix du MAB. Paramètres de tri peut être ajusté en fonction de l'exigence de pureté et de rendement. Bien FACS nécessite un équipement spécialisé et la formation du personnel, c'est la méthode de choix pour l'isolement des populations de cellules hautement purifiées.
FACS est une technique très sophistiquée de purification des populations de cellules d'intérêt, dans laquelle une très grande pureté (95-100%) de la population triés peuvent être obtenues. Par conséquent, cette technique est particulièrement important pour des expériences, où une grande pureté est une exigence essentielle (par exemple l'analyse des microréseaux). FACS est particulièrement avantageux par rapport aux autres méthodes disponibles de purification où une population de cellules doit être purifié basé sur un marqueur de surface exprimées par semaine ou lorsque deux ou plusieurs populations ont besoin d'être purifié qui ont différents niveaux d'expression du marqueur de même surface. Par exemple, la purification de la zone marginale cellules B (CD21 + B220 Salut CD23 int / basse) et B folliculaire cellules (B220 + CD21 int / basse CD23 Salut) basé sur les niveaux d'expression de CD21 et CD23. Une autre application croissante de la FACS est tri cellulaire unique permettant l'analyse des cellules individuelles (3, 4). FACS est aussi couramment utilisé pour trier les cellules exprimant des protéines fluorescentes qui sont génétiquement exprimées, telles que le vert protéines protéine fluorescente marqués (5). Si une sorte stériles est effectuée, les cellules peuvent être cultivées. Cependant, la viabilité cellulaire et le rendement peut être compromise lors du tri. La viabilité peut être améliorée en utilisant une température dépendant des cellules optimales pour le tri et le traitement par les tubes de prélèvement immédiatement après avoir atteint la capacité. La récupération peut être augmentée en utilisant des tubes de prélèvement en polypropylène, la collecte de cellules triées dans le sérum rich media et des tubes de prélèvement inversant par intermittence, le maintien des tubes de prélèvement à une température optimale et la centrifugation des cellules triées pour ~ 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm).
Le développement de l'ultra haute vitesse trieurs a étendu la possibilité de l'application du tri des flux dans les milieux cliniques. Les applications cliniques potentielles de la FACS comprennent la purification de cellules souches sanguines du sang humain à des fins thérapeutiques, les applications dans le traitement du cancer, le remplacement amniocentèse, tri des spermatozoïdes humains et les détections précoce de la maladie (6, 7).
Pour la coloration multicolore, la sélection d'anticorps est une étape critique et fluorochromes sont choisis en fonction du système de détection pour chaque instrument en particulier. Il ya un certain nombre de compagnies qui vendent des trieurs de cellules et de la configuration du laser varie en fonction des besoins des utilisateurs. Ainsi, on ne peut pas simplement utiliser les anticorps utilisés dans exactement les mêmes études publiées sans confirmer la compatibilité. Pour la sélection d'anticorps optimal, on doit considérer le niveau d'expression de la protéine à l'étude. En général, les plus brillants disponibles anticorps marqués au fluorochrome doit être utilisé pour colorer les marqueurs de surface faiblement exprimés, tandis que fluorochromes DIM peut être utilisée pour la coloration des marqueurs de surface fortement exprimée (8). En outre, les anticorps doivent être choisis de telle manière que les chevauchements entre leurs spectres d'émission est minime. Pour la coloration multicolore, il est extrêmement difficile de choisir un fluorochrome qui n'ont pas de chevauchement spectral. Dans cette situation, la compensation est effectuée.
La rémunération est mathématiquement nécessaire pour éliminer le chevauchement entre le spectre de fluorescence des émissions des fluorochromes différents qui est mesurable par les détecteurs (8-10). En d'autres termes, le chevauchement de fluorescence d'un fluorochrome est soustrait du spectre des émissions d'un autre fluorochrome. Le calcul de la compensation requiert un contrôle sans tache et simple des contrôles positifs pour chaque fluorochrome utilisé pour une coloration multicolore (9, 10). La compensation peut être réalisée en utilisant des cellules ou des perles. Les perles sont faciles à colorer, avoir un signal robuste et offrent un moyen facile de préparer seul contrôle qui ont teinté les fluorophores même que les échantillons expérimentaux. Perles de rémunération sont particulièrement avantageux lorsque la protéine de surface cellulaire d'intérêt est exprimé à un niveau bas et quand la population cellulaire d'intérêt est de limiter dans la population cellulaire initiale de départ.
Une fois que les anticorps ont été choisis, leur activité doit être optimisée en effectuant une analyse de titration. Ceci est particulièrement important si la machine FACS a lasers très puissants. L'utilisation de concentrations suboptimales d'anticorps coloration peut entraîner une mauvaise séparation de la population cellulaire désirée de la population cellulaire totale. L'utilisation de concentrations élevées d'anticorps augmente les chances pour antigène non spécifique coloration. Par conséquent titrage d'anticorps permettant la sélection de la concentration en anticorps qui donne la luminosité maximale de la population positive et une coloration de fond minimal (8).
FACS est maintenant une technique standard pour la purification des sous-populations de cellules. Il peut être utilisé pour séparer n'importe quel type cellulaire dans lequel une suspension cellulaire unique peut être généré et les anticorps sont disponibles pour identifier la population cellulaire désirée. FACS est la méthode de choix quand highly populations de cellules pures sont nécessaires.
Nous tenons à remercier le Dr Bill Cashdollar pour son soutien dans l'utilisation de la cytométrie de flux de base.