עבור מחקרים מדעיים רבים הדורשים ניתוח ביולוגי וכימי של אוכלוסיות תאים תאים חייב להיות במצב גבוה של טוהר. תא Fluorescence מיון מופעל (FACS) היא שיטה מעולה בו כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהור.
מחקרים ניסיוניים וקליניים לעיתים קרובות דורשים מטוהרים מאוד אוכלוסיות תאים. FACS היא טכניקה של בחירה כדי לטהר אוכלוסיות תאים של פנוטיפ ידוע. עיקר שיטות אחרות של טיהור כוללות צילום פנורמי, דלדול להשלים חרוז הפרדה מגנטי. עם זאת, FACS יש מספר יתרונות על פני השיטות הזמינות האחרות. FACS היא השיטה המועדפת כאשר הטוהר גבוהה מאוד של האוכלוסייה הרצויה נדרשת, כאשר האוכלוסייה תא היעד מבטא רמה נמוכה מאוד של הסמן, או כאשר זיהוי אוכלוסיות תאים דורשים הפרדה על בסיס צפיפות סמן ההפרש. בנוסף, FACS היא הטכניקה רק טיהור זמין לבודד תאים בהתבסס על מכתים פנימי או ביטוי חלבונים תאיים, כגון סמן מהונדסים גנטית חלבון פלואורסצנטי. FACS מאפשרת טיהור של תאים בודדים גרעיניות על בסיס גודל, פלואורסצנטי. על מנת לטהר את התאים של עניין, הם מוכתמים הראשון עם fluorescently-tagged נוגדנים חד שבטיים (מב), אשר מזהה סמנים ספציפיים על פני האוכלוסייה התא הרצוי (1). סלקציה שלילית של תאים בלא כתם הוא גם אפשרי. טיהור FACS דורש cytometer לזרום עם מיון קיבולת התוכנה המתאים. עבור FACS, תאים ההשעיה מועברים כזרם בטיפות עם שכל אחת מהן מכילה תא בודד מול לייזר. מערכת גילוי הקרינה מזהה תאים של עניין על פי פרמטרים שנקבעו מראש ניאון של התאים. מכשיר חל חיוב אגל המכיל תא עניין ומערכת סטיה אלקטרוסטטי מקלה אוסף של טיפות טעון לתוך צינורות איסוף המתאים (2). ההצלחה של מכתים ובכך מיון תלוי במידה רבה על הבחירה של סמנים לזיהוי הבחירה של MAB. פרמטרים של מיון יכול להיות מותאם בהתאם לדרישה של טוהר ואת התשואה. למרות FACS דורש ציוד מיוחד והכשרה אדם, היא שיטת הבחירה של בידוד מטוהרים מאוד אוכלוסיות תאים.
FACS היא טכניקה מתוחכמת ביותר לטיהור אוכלוסיות תאים בעלי עניין, שבה הטוהר גבוהה מאוד (95-100%) של האוכלוסייה מיון ניתן להשיג. לכן, טכניקה זו היא חשובה במיוחד עבור ניסויים, שבהם טוהר גבוהה היא תנאי הכרחי (למשל ניתוח microarray). FACS יתרון במיוחד על השיטות הזמינות האחרות של טיהור, כאשר האוכלוסייה התא צריך להיות מטוהרים מבוסס על סמן משטח השבועית הביע או כאשר שניים או יותר אוכלוסיות צריכים להיות מטוהרים אשר יש רמות שונות של ביטוי סמן את פני השטח אותו. לדוגמה, טיהור אזור שוליים B תאים (B220 + CD21 CD23 היי int / נמוך) ו-B פוליקולרית תאים (B220 + CD21 int / נמוך היי CD23) בהתבסס על רמות ביטוי של CD21 ו – CD23. יישום נוסף הוא גדל והולך של FACS מיון תא יחיד ומאפשר ניתוח של תאים בודדים (3, 4). FACS הוא גם נפוץ בתאי מין הבעת חלבוני ניאון כי הם הביעו גנטית, כגון חלבונים חלבון פלואורסצנטי ירוק מתויג (5). אם מעין סטרילי מתבצע התאים יכול להיות מתורבת. עם זאת, כדאיות התא ואת התשואה אפשר להתפשר במהלך המיון. הכדאיות ניתן לשפר באמצעות תא תלויי טמפרטורה אופטימלית למיון ועל ידי צינורות עיבוד אוסף מיד אחרי שהם מגיעים קיבולת. השחזור ניתן להגדיל באמצעות אוסף צינורות פוליפרופילן, איסוף תאים ממוינים מדיה עשירה בסרום וצינורות אוסף היפוך לסירוגין, שמירה על צינורות אוסף בטמפרטורה אופטימלית centrifuging תאים ממוינים דקות 10 ~ (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm).
הפיתוח של מהירות גבוהה במיוחד sorters האריך את האפשרות של יישום של מיון תזרים במסגרות קליניות. יישומים קליניים הפוטנציאל של FACS כוללים טיהור בתאי גזע של דם דם אדם למטרות טיפוליות, יישומים בטיפול בסרטן, החלפת בדיקת מי שפיר, מיון זרע אנושי לתגליות המחלה מוקדם (6, 7).
עבור מכתים ססגוניות, מבחר נוגדן היא צעד קריטי fluorochromes נבחרים מבוסס על מערכת זיהוי כל מכשיר מסוים. ישנן מספר חברות שמוכרות sorters התא התצורה לייזר משתנה לפי צרכי המשתמש. לכן אי אפשר פשוט להשתמש נוגדנים בדיוק משמש מחקרים שפורסמו ללא אישור תאימות. עבור מבחר נוגדן אופטימלי, יש לשקול את רמת הביטוי של החלבון הנבדק. באופן כללי, נוגדנים הבהיר fluorochrome-tagged זמין צריך לשמש כתם סמנים השטח לידי ביטוי עמום, בעוד fluorochromes עמום יכול לשמש מכתים את פני השטח של סמנים הביע ביותר (8). בנוסף, נוגדנים יש לבחור בצורה כזאת, כי חפיפה בין ספקטרום הפליטה שלהם היא מינימלית. עבור מכתים ססגוניות, קשה מאוד לבחור fluorochrome כי אין חפיפה ספקטרלית. במצב זה, פיצוי מבוצע.
פיצויים יש צורך לחסל את מתמטית חפיפה בין ספקטרום הקרינה את פליטות של fluorochromes שונים זה שניתן לכמת ידי גלאי (80-10). במילים אחרות, חופפים את הקרינה מאחד fluorochrome מופחת ספקטרום פליטת אחר fluorochrome. חישוב הפיצוי דורש שליטה בלא כתם בקרות חיובי יחיד לכל fluorochrome המשמש מכתים ססגוניות (9, 10). הפיצוי ניתן לבצע באמצעות תאים או חרוזים. החרוזים קל כתם, יש אות חזקים מספקים דרך קלה להכנת שולטת מוכתם יחיד כי יש fluorophores זהה דגימות הניסוי. חרוזים פיצויים הם יתרון במיוחד כאשר שטח פני התא חלבון עניין מתבטאת ברמה נמוכה וכאשר אוכלוסיית תאים של הריבית הגבלת באוכלוסייה התא הראשוני ההתחלה.
לאחר נוגדנים נבחרו, הפעילות שלהם צריך להיות מותאם על ידי ביצוע ניתוח טיטרציה. הדבר חשוב במיוחד אם המכשיר FACS יש לייזרים רבי עוצמה ביותר. השימוש בריכוזים הכי מוצלח של נוגדנים מכתים יכול לגרום ההפרדה עניים האוכלוסייה התא הרצוי מתוך האוכלוסייה תא מוחלט. השימוש ריכוזי נוגדנים גבוה מגביר את הסיכוי מכתים אנטיגן בלתי ספציפי. לכן טיטרציה נוגדן יאפשר את הבחירה של ריכוז הנוגדנים שנותן בהירות מקסימלית של האוכלוסייה חיובית מכתים רקע מינימלי (8).
FACS עכשיו היא טכניקה תקן לטיהור של subpopulations של תאים. זה יכול לשמש כדי להפריד כל סוג התא שבו ההשעיה תא בודד ניתן להפיק נוגדנים זמינים כדי לזהות את האוכלוסייה התא הרצוי. FACS היא השיטה של בחירה כאשר highly אוכלוסיות תאים טהור נדרשים.
ברצוננו להודות Cashdollar ד"ר ביל תמיכתו בשימוש Core cytometry הזרימה.