För många vetenskapliga studier som kräver en biologisk och kemisk analys av cellpopulationer cellerna måste vara i en hög tillstånd av renhet. Fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) är en överlägsen metod där för att få rena cellpopulationer.
Experimentella och kliniska studier kräver ofta mycket rent cellpopulationer. FACS är en teknik val för att rena cellpopulationer av kända fenotyp. Andra delen metoder för rening inkluderar panorering, kompletterar utarmning och magnetiska pärla separation. Dock har FACS flera fördelar jämfört med andra tillgängliga metoder. FACS är den bästa metoden när mycket hög renhet av önskad befolkningen krävs, när målcellpopulationen uttrycker en mycket låg nivå identifiera markör eller när cellpopulationer kräver separation baserad på differentiell markör densitet. Dessutom är FACS den enda tillgängliga reningsteknik att isolera celler baserat på interna färgning eller intracellulärt protein uttryck, såsom en genetiskt modifierad fluorescerande protein markör. FACS medger rening av enskilda celler baserat på storlek, granularitet och fluorescens. För att rena celler av intresse, är de först färgats med fluorescerande-märkta monoklonala antikroppar (mAb), som erkänner specifik yta markörer på önskad cellpopulation (1). Negativt urval av ofärgade celler är också möjligt. FACS rening kräver en flödescytometer med sortering kapacitet och lämplig mjukvara. För FACS, celler i suspension skickas som en ström i små droppar med var och en innehåller en enda cell framför en laser. Fluorescensen upptäckt systemet upptäcker celler av intresse grundar sig på förutbestämda fluorescerande parametrar av cellerna. Instrumentet tillämpar en avgift för att droppen som innehåller en cell av intresse och en elektrostatisk nedböjning Systemet underlättar insamling av laddade droppar in lämpliga insamlingssystem rör (2). Framgången för färgning och därmed sortering stor del beror på valet av att identifiera markörer och valet av MAB. Sortering parametrar kan justeras beroende på kravet på renhet och avkastning. Även FACS kräver specialiserad utrustning och utbildning av personal, är det viktigaste metoden för isolering av renade cellpopulationer.
FACS är en mycket avancerad teknik för att rena cellpopulationer av intresse, där en mycket hög renhet (95-100%) av det sorterade befolkningen kan erhållas. Därför är denna teknik särskilt viktigt för experiment, där hög renhet är ett grundläggande krav (t.ex. microarray analys). FACS är särskilt fördelaktigt jämfört med andra tillgängliga metoder för rening när en cell population måste renas baseras på ett uttryck vecka yta markör eller när två eller flera populationer måste renas som har olika uttryck för samma yta markör. Till exempel rening av marginella zon B-celler (B220 + CD21 hi CD23 int / låg) och follikulärt B-celler (B220 + CD21 int / låg CD23 hi) baserat på uttryck nivåer av CD21 och CD23. Ett annat växande tillämpning av FACS är enda cell sortering gör en analys av enskilda celler (3, 4). FACS är också vanligt att sortera celler som uttrycker fluorescerande proteiner som är genetiskt uttryck, såsom gröna fluorescerande proteinet taggade proteiner (5). Om en steril sortera utförs cellerna kan odlas. Däremot kan cellviabiliteten och avkastningen äventyras under sorteringen. Lönsamheten kan förbättras med hjälp av en cell beroende optimala temperaturen för sortering och genom att bearbeta Uppsamlingsrör omedelbart efter de når kapacitet. Återhämtning kan ökas genom att använda rör av polypropylen insamling, samla sorterade celler i serum rik media och vända rören samling intermittent, underhålla samlingen rör vid en optimal temperatur och centrifugering sorteras celler för ~ 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm).
Utvecklingen av ultrahög hastighet sorterare har utökat möjligheten att tillämpningen av flödet sortering i kliniska situationer. Den eventuella kliniska tillämpningar av FACS inkluderar rening av blodstamceller från mänskligt blod för terapeutiska syften, applikationer inom cancerterapi, fostervattensprov ersättning, sortering mänskliga spermier och tidig detektion sjukdom (6, 7).
För multicolor färgning är antikropp välja ett kritiskt steg och fluorokromer väljs bygger på att upptäcka för varje enskilt instrument. Det finns ett antal företag som säljer cell sorterare och laser konfiguration varierar beroende på användarnas behov. Således kan man inte helt enkelt använda exakt samma antikroppar används i publicerade studier utan att bekräfta kompatibilitet. För optimal antikropp val, bör man överväga uttrycket nivån av proteinet som undersöks. I allmänhet bör den ljusaste som finns fluorokrom-märkta antikroppar användas för att färga dunkelt uttryckt ytan markörer, medan dim fluorokromer kan användas för färgning av hög grad uttryckt ytan markörer (8). Dessutom bör antikroppar väljas på ett sådant sätt som överlappar bland sina emissionsspektra är minimal. För multicolor färgning är det mycket svårt att välja fluorokrom som inte har någon spektral överlappning. I denna situation är ersättning utförs.
Ersättning krävs för att matematiskt eliminera fluorescens överlappning mellan utsläpp spektrum av de olika fluorokromer som är mätbara med detektorer (8-10). Med andra ord är den överlappning fluorescens från ett fluorokrom subtraheras från utsläpp spektrum av annan fluorokrom. Ersättningen Beräkningen förutsätter en ofärgade kontroll och enda positiva kontroller för varje fluorokrom användas för en mångfärgad färgning (9, 10). Ersättning kan utföras med hjälp av celler eller pärlor. Pärlorna är lätta att färga, har en robust signal och ett enkelt sätt att förbereda enda färgade kontroller som har samma fluoroforer som den experimentella prover. Ersättning pärlor är särskilt fördelaktigt när cellytan proteinet av intresse uttrycks på en låg nivå och när cellpopulation begränsar i den inledande start cellpopulation.
När antikroppar har valts, bör deras verksamhet kan optimeras genom att utföra en titrering analys. Detta är särskilt viktigt om FACS maskinen har mycket kraftfulla lasrar. Användningen av suboptimala koncentrationer av färgning antikroppar kan leda till dålig separation av den önskade cellen befolkningen från den totala cellpopulation. Användning av höga antikroppskoncentration ökar chansen för antigen icke-specifik färgning. Därför antikroppstiter kommer att tillåta val av antikroppskoncentrationen som ger den maximala ljusstyrkan på positiva befolkningen och minimal bakgrundsfärgning (8).
FACS är nu en standardiserad teknik för rening av subpopulationer av celler. Den kan användas för att separera alla celltyper i vilka en cellsuspensionen kan genereras och antikroppar är tillgängliga för att identifiera den önskade cellen befolkningen. FACS är den metod som föredras när highly rena cellpopulationer behövs.
Vi vill tacka Dr Bill Cashdollar för hans stöd i användningen av Flödescytometri Core.