Den zebrafisk maxillary skäggtöm är en integumentary sinnesorgan som innehåller ektodermal, mesodermal och neurala derivat krön. Viktigare, kan den vuxna skäggtöm regenerera efter proximal amputation. Denna video presenterar överkäken skäggtöm utveckling och visar ett kirurgiskt protokoll för att få förnyelse, följt av insamling, inbäddning och nedströms avbildning av skäggtöm exemplar.
Skäggtömmar är hud sensoriska bihang som finns i fiskar, reptiler och amfibier. Den zebrafisk, Danio rerio, utvecklar två par skäggtömmar-kort nasal par och en längre maxillary par. Barbel vävnad innehåller celler av ektodermal, mesodermal och neurala crest ursprung, inklusive hudceller, körtlar, smaklökar, melanocyterna, fartyg cirkulationsrubbningar och sensoriska nerver. Skillnad från de flesta vuxna vävnader, är maxillary skäggtöm optiskt klar, tillåter oss att visualisera utveckling och underhåll av dessa typer av vävnad under hela livscykeln.
Denna video visar tidiga utvecklingen av att käk skäggtöm (början cirka en månad efter befruktningen) och visar ett kirurgiskt protokoll för att få förnyelse i den vuxna bihang (> 3 månader efter befruktning). Kortfattat är den vänstra överkäken skäggtöm av en sövda fisk förhöjda med steril pincett precis distalt om den bakre kanten av överkäke. En fin, sterila våren sax är placerad mot pincett för att klippa skäggtöm axeln på denna nivå, upprättande av en anatomisk landmärke för amputation planet. Regenerativ tillväxt kan mätas med avseende på detta plan, och i jämförelse med det kontralaterala skäggtöm. Barbel vävnader regenererar snabbt och når maximal återväxt inom 2 veckor efter skadan.
Tekniker för att analysera regenererade skäggtöm inkluderar dissekera och inbäddning matchade par skäggtömmar (regenererar och kontroll) i brunnarna i en vanlig DNA-elektrofores gel. Inbäddade exemplar är bekvämt fotograferade under ett stereomikroskop för grov morfologi och morfometri, och kan lagras i veckor innan nedströms applikationer såsom paraffin histologi, cryosectioning och / eller hela montera immunohistokemi. Dessa metoder fastställa maxillary skäggtöm som en ny in vivo vävnader för att studera förnyelseförmåga flera celltyper i genetiska sammanhang zebrafisk.
Den zebrafisk maxillary skäggtöm är en underutnyttjad vävnad för att studera tillväxt, underhåll och förnyelse av flera celltyper i zebrafisk. Även om skäggtöm bihang har inga mänskliga analoga, är de celltyper den innehåller starkt konservativa, vilket gör det möjligt att studera hud, körtlar, melanocyterna, cirkulationsrubbningar fartyg och nerver i ett optiskt klara och anatomiskt enkel cylindrisk struktur. I likhet med väl studerade stjärtfenan, kan skäggtöm vävnad förmås att återskapa genom amputation. Använda gränsen till överkäken som anatomiska landmärke kan amputation planet placeras exakt, vilket underlättar mätning av skäggtöm återväxt. För en erfaren operatör tar varje operation bara några sekunder. Återvinning är snabb, och vi har hittills upptäckt några korta eller långsiktiga effekter på fisk beteende. Zebrafisk med en maxillary skäggtöm bada, äta och ras så effektivt som icke-kirurgiska kontroller, och har jämförbara överlevnad till tiden av vävnad samling, upp till 6 månader efter operationen. Den fysiologiska effekten av denna operation förväntas vara minimal, eftersom 1) den extraorala smaklökar transporteras på skäggtöm finns också på många andra delar av fisken epitel, inklusive läppar, kinder och huvud 5, och 2) att skilja smaklökar visas på den regenererande skäggtöm inom 72 timmar (LeClair et al. opublicerade data.) Detta gör maxillary skäggtöm en minimalinvasiv system för att studera sårläkning, revaskularisering och reinnervation inom ramen för en vuxen ryggradsdjur.
Efter kirurgisk induktion av förnyelse kan skäggtömmar samlas med jämna mellanrum för morfometriska mätningar och / eller mikroskopisk analys av fast vävnad. Bekvämt är maxillary skäggtöm ungefär längden (2-3 mm) och diameter (100-200 mm) av en zebrafisk embryo, underlätta tillämpningen av många standardprotokoll, inklusive paraffin histologi, cryosectioning, hel-fäste immunohistokemi och in situ hybridisering. Sammantaget gör dessa funktioner att käk skäggtöm en mycket möjlig in vivo modell för att studera vävnad reparation och förnyelse.
Dessa metoder har utvecklats av EEL under ett forskningsprojekt lämnar i labbet av JT Stöd lämnades av DePaul University Vetenskapsrådet och en NIH / NIDCR R01 bidrag till JT (DE016678). Vi erkänner tacksamt insatser Caroline Hunter, djurvård tekniker i CMRC zebrafisk core facility och Paulina Pawluczuk, vår grundutbildning laboratorieassistent.
Microscope Equipment
A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.
Barbel Clipping
Tissue collection and agar embedding