zebrafish दाढ़ की हड्डी का barbel एक कोल का अर्थ बहिर्जनस्तरीय, mesodermal और तंत्रिका शिखा डेरिवेटिव युक्त अंग है. महत्वपूर्ण बात, वयस्क barbel प्रॉक्सिमल विच्छेदन के बाद पुनर्जीवित कर सकते हैं. इस वीडियो दाढ़ की हड्डी का barbel विकास का परिचय और पुनर्जनन प्रेरित के एक शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल, barbel नमूनों के संग्रह एम्बेडिंग, और नीचे की ओर इमेजिंग द्वारा पीछा दर्शाता है.
Barbels त्वचा संवेदी मछलियों, reptiles और amphibians में पाया appendages के हैं. zebrafish, Danio rerio, barbels – एक छोटी नाक जोड़ी और एक अब दाढ़ की हड्डी का जोड़ी के दो जोड़े को विकसित करता है . Barbel ऊतक बहिर्जनस्तरीय mesodermal, और तंत्रिका शिखा मूल की कोशिकाओं, त्वचा कोशिकाओं, ग्रंथियों, स्वाद, melanocytes, संचार वाहिकाओं और संवेदी तंत्रिकाओं सहित शामिल हैं. सबसे वयस्क ऊतकों के विपरीत, दाढ़ की हड्डी का barbel ऑप्टिकली स्पष्ट है, हमें जीवन चक्र के दौरान और इन प्रकार के ऊतकों के विकास और रखरखाव कल्पना करने के लिए अनुमति देता है.
यह वीडियो दाढ़ की हड्डी का barbel (लगभग एक महीने बाद निषेचन की शुरुआत) के प्रारंभिक विकास से पता चलता है और एक शल्य चिकित्सा के लिए वयस्क उपांग (> 3 महीने बाद निषेचन) में पुनर्जनन प्रेरित प्रोटोकॉल को दर्शाता है. संक्षेप में, एक anesthetized मछली की बाईं दाढ़ की हड्डी का barbel बाँझ सिर्फ maxilla की दुम किनारे करने के लिए बाहर का संदंश के साथ ऊंचा है. एक ठीक है, बाँझ वसंत कैंची संदंश के खिलाफ तैनात है के लिए इस स्तर पर barbel शाफ्ट में कटौती, विच्छेदन विमान के लिए एक संरचनात्मक मील का पत्थर स्थापित. पुनर्योजी विकास के इस विमान को सम्मान के साथ और contralateral barbel की तुलना में मापा जा सकता है. Barbel ऊतक तेजी से पुन: बनाता है, चोट के 2 हफ्तों के के भीतर अधिक से अधिक regrowth तक पहुँचने.
पुनर्जीवित barbel का विश्लेषण करने के लिए तकनीकों शामिल विदारक और एम्बेडिंग एक मानक डीएनए वैद्युतकणसंचलन जेल के कुओं में barbels के मिलान जोड़े (पुनर्जन्म और नियंत्रण). एंबेडेड नमूनों सुविधा सकल आकारिकी और morphometry के लिए एक stereomicroscope के तहत फोटो खिंचवाने हैं, और पैराफिन ऊतक विज्ञान जैसे बहाव आवेदन करने के लिए पहले सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है, cryosectioning, और / या पूरे माउंट immunohistochemistry. दाढ़ की हड्डी का barbel स्थापित zebrafish की आनुवंशिक संदर्भ में कई प्रकार की कोशिकाओं के पुनर्योजी क्षमता के अध्ययन के लिए vivo में ऊतकों प्रणाली में एक उपन्यास के रूप में इन विधियों.
zebrafish दाढ़ की हड्डी का barbel एक underutilized, zebrafish में कई प्रकार की कोशिकाओं के विकास, रखरखाव और उत्थान के अध्ययन के लिए ऊतक प्रणाली है. हालांकि barbel उपांग कोई मानव अनुरूप है, सेल प्रकार यह होता है अत्यधिक, संरक्षित कर रहे हैं त्वचा, ग्रंथियों, melanocytes, संचार और एक ऑप्टिकली स्पष्ट और anatomically सरल बेलनाकार संरचना में वाहिकाओं नसों का अध्ययन करने के लिए यह संभव बना. अच्छी तरह से अध्ययन किया दुम फिन के लिए इसी प्रकार, barbel ऊतकों को विच्छेदन के द्वारा पुनर्जीवित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है है. एक संरचनात्मक मील का पत्थर के रूप में maxilla की सीमा का उपयोग, विच्छेदन विमान ठीक रखा जा सकता है, barbel regrowth की माप की सुविधा. एक अनुभवी ऑपरेटर के लिए, प्रत्येक सर्जरी केवल कुछ सेकंड लेता है. वसूली तेजी से है, और हम इतने तक मछली के व्यवहार पर कोई छोटी या लंबी अवधि के प्रभाव का पता चला है. एक दाढ़ की हड्डी का barbel तैरने के साथ Zebrafish खाने, और गैर शल्य नियंत्रण के रूप में नस्ल के रूप में प्रभावी ढंग से, और ऊतक संग्रह के समय तुलनीय अस्तित्व है सर्जरी के बाद 6 महीने. इस सर्जरी के शारीरिक प्रभाव कम हो क्योंकि 1) extraoral स्वाद barbel पर किया कलियों भी मछली उपकला के कई अन्य भागों, होंठ, गाल और 5 सिर सहित, पर पाए जाते हैं की भविष्यवाणी की, और 2) फर्क स्वाद पर दिखाई देते हैं regenerating barbel (LeClair एट अल. अप्रकाशित डेटा.) के 72 घंटे के भीतर इस दाढ़ की हड्डी का एक वयस्क हड्डीवाला के संदर्भ के भीतर घाव भरने, revascularization, और reinnervation के अध्ययन के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव प्रणाली barbel बनाता है.
उत्थान की शल्य चिकित्सा शामिल के बाद, barbels morphometric माप और / या तय ऊतक के सूक्ष्म विश्लेषण के लिए अंतराल पर एकत्र किया जा सकता है. सुविधा, दाढ़ की हड्डी का barbel लगभग (2-3 मिमी) लंबाई और एक zebrafish भ्रूण के व्यास (1-200 मिमी), पैराफिन ऊतक विज्ञान सहित कई मानक प्रोटोकॉल, आवेदन की सुविधा, पूरे माउंट immunohistochemistry, और बगल में cryosectioning संकरण. साथ में ले ली, इन सुविधाओं दाढ़ की हड्डी का एक अत्यधिक ऊतकों की मरम्मत और उत्थान के अध्ययन के लिए vivo मॉडल में संभव barbel बनाते हैं.
इन विधियों बाममछली द्वारा संयुक्त समर्थन DePaul विश्वविद्यालय अनुसंधान परिषद और एक NIH / NIDCR R01 (DE016678) संयुक्त अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी की प्रयोगशाला में एक शोध के अवकाश के दौरान विकसित किए गए. हम कृतज्ञता कैरोलीन हंटर, जानवर CMRC zebrafish कोर सुविधा में देखभाल तकनीशियन और Paulina Pawluczuk, हमारे स्नातक प्रयोगशाला सहायक के प्रयासों को स्वीकार करते हैं.
Microscope Equipment
A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.
Barbel Clipping
Tissue collection and agar embedding