Summary
一种新的手段使用荧光多巴胺类似物的光学测量神经递质。
Abstract
中枢神经系统神经元之间通过突触囊泡融合过程中的神经递质释放的信号传输。观察神经递质的摄取和释放个人直接突触前终端，我们设计了荧光假神经递质的突触囊泡单胺转运体的基板。我们使用这些探头形象在纹状体多巴胺的释放，突触可塑性相关的若干意见。我们发现，每刺激释放神经递质的突触小泡的一小部分是依赖于刺激频率。这些实验条件下未观察到一个动力学鲜明的“储备”突触囊泡人口。一个依赖于频率的异质性突触前终端显示，依赖D2多巴胺受体的一部分，表明了突触前的选择依赖于频率的编码机制。
张辉和尼科G. Gubernator的贡献同样对这项工作。
Protocol
使用这种方法在研究中报道的Gubernator 等人，科学 324（5933）。 1441-1444（2009） 。
1。急性纹状体切片准备
- 准备急性纹状体片之前，必须氧气的人造脑脊液（ASCF）和冷却用冰前至少15分钟，大脑提取。保持学联冰冷和含氧在解剖。学联（毫米）：125氯化钠，2.5氯化钾，碳酸氢钠3月 26日，氯化钙2.4，硫酸镁1.3，KH 2 PO 4 0.3，葡萄糖10，HEPES 5，pH值7.3-7.4，290-295 mOsm。
- 杀头无需麻醉雄性小鼠。
- 从小鼠中提取的全脑，并安装使用Krazy ®胶水vibratome上vibratome托盘。脑提取和安装，必须在2分钟内完成。在这段时间内，一定要保持学联冰冷和含氧保持组织的健康。
- 切割厚度在250微米之间囟1.54 0.62 1冠状纹状体的脑切片。这样就可以削减到6个半片，用针将获得整整3片。
- 含氧学联在室温孵育探头负载前至少1小时的脑切片。片显示良好FFN511加载，并保持积极成像长达4小时后切片准备。
2。载入FFN511
- 准备FFN511装载解决方案（10μMFFN511学联），还准备在学联100μm的ADVASEP - 7。所有的解决方案应准备新鲜和含氧加载到片之前至少15分钟。
- 单独孵育FFN511 30分钟，在室温下加载溶液片。
- 然后删除约束孵化100μm的含氧ADVASEP - 7学联为30分钟，在室温下 2装入片外组织的染料。现在切片成像准备。
3。在大脑切片成像FFN511
FFN511成像切片是使用多光子激光扫描显微镜进行。我们使用的是一个草原终极多光子激光扫描显微镜（以前我们使用的Zeiss LSM 510 NLO多光子激光扫描显微镜和取得了一定的成效，与蔡司显微镜）。
- 将在录音室FFN511装片（RC - 27L，华纳）在1-2毫升，每分钟的流量和含氧学联superfuse。然后将切片上的尼龙绳铂金竖琴在实验过程中，尽量减少运动。为了进一步减少运动，让片，影像稳定之前至少10分钟，在会议厅内。
- 可视化和定位的10倍水浸泡的目标下的明亮的领域发光的背侧纹状体。
- 在这一地区的地点和位置的两极扭曲钨电极，如果执行刺激实验。理想的成像区域位于内300微米之间的刺激双极电极的两个小技巧。放置在视野的中心区域。
- 图片FFN511标记下一个63X（0.9 NA）的水浸泡紫外线目标纹状体终端。 FFN511是兴奋与麦大激光光谱物理和纹状体终端的最佳荧光，在760纳米，是通过一个带通滤波器（480-520纳米）。 75 × 75微米地区的利益，在512 × 512像素分辨率与12位格式拍摄的图像。为刺激脱色实验，以弥补Z轴转移，5-7图像的Z系列，相隔1微米在z平面，获得每个时间段。
4。 FFN511脱色
destained FFN511标签可以通过高浓度氯化钾（我们使用70毫米氯化钾），（+），安非他明类兴奋剂的硫酸盐（AMPH，20微米），或电刺激。在氯化钾脱色实验，当高的钾学联解决方案适用于脑片，FFN511在2分钟内标签destains。记录XYZ - T图像随着时间的推移跟踪FFN511脱色。下面介绍了电刺激依赖多巴胺终端脱色：
- 随着时间的推移跟踪FFN511脱色，XYZ - T的图像记录。为了确保最小的片运动（Z轴少于4微米）并没有漂白Z - Stack的激光，控制时间序列图像，应取得至少5分钟前刺激。否则，调整激光功率。
- 这些控制图像之后，继续XYZ - T成像，同时启动的刺激频率1，4或20赫兹。 1，4或20 Hz（300微秒× 1毫安）的刺激，适用于本地纹状体通过ISO - Flex的刺激，引发主8脉冲发生器使用双极电极（AMPI，耶路撒冷，以色列）隔离。为了尽量减少在发布网站的去极化的变化，我们已经使用了刺激协议应用循环伏安法确定的最大刺激强度的150％。
- 使用适当的软件成像分析。在我们的实验室中，我们使用图像J（韦恩Rosband，美国国立卫生研究院，洛克维尔，MD）和自定义编写的软件在IDL（研究系统，博尔德，CO）的量化与时间3 puncta荧光的变化。
Represenative结果
图1显示FFN511加载到纹状体切片，现在已经完成。代表使用10倍和60倍的目标的图像如图1所示。多巴胺终端的选择性标签可以destained 20μM的安非他明。
图2显示了FFN511高氯化钾标签脱色。
图3所示的FFN511标签由当地的电刺激脱色。
图1 FFN511标签多巴胺终端，在现场的皮质-纹状体急性片（一）标记FFN511急性现场皮质纹状体切片。丰富的标签在纹状体（STR）的，稀疏的皮质标签（CTX），并没有标签胼胝体（CC）的。比例尺：100微米（二）由安非他明纹状体FFN511脱色。左侧面板：前安非他明类兴奋剂;右图：20μM的安非他明20分钟后。比例尺：10微米。
图2。FFN511高氯化钾标签脱色。 FFN511标签destained在2分钟70毫米氯化钾在学联的应用。比例尺：10μm的。
图3。FFN511纹状体标签的频率依赖性脱色。（一 ）在4赫兹的局部刺激导致脱色从终端。在t = 0开始的刺激。比例尺：5微米（二）FFN511脱色4赫兹的Ca 2 + -和频率依赖性。控制收到无刺激（153 puncta从3片）。氯化镉（200μM）的脱色未刺激控制（475 puncta从5片）相同。由一个单一的指数衰减函数和半衰期（T 1 / 2）每个刺激频率的脱色曲线拟合值计算τx 0.693（1赫兹：765 puncta从9片，4赫兹：410 puncta从7片， 20赫兹：6片）416 puncta。请参阅期间在纹状体脑片制备的胞外分泌FFN511脱色的双光子显微镜视频显微镜。
Discussion
在这段视频中，我们展示了一种方法，使用荧光多巴胺类似物光学可视化的神经传递。 FFN511是我们已经开发出第一代的FFNs。虽然它的目的是针对神经元囊泡单胺转运体（VMAT2），携带从细胞质进入突触囊泡单胺类神经递质，并专门标签在皮质纹状体和推定儿茶酚胺和/或羟色胺终端的多巴胺终端（在科学所示纸），适当的装载期间是关键的特殊性，因为FFN511是相对的疏水性。我们发现，孵化的时间超过40分钟，将导致在纹状体切片广泛的非特异性染色。脱色使用高浓度的氯化钾，应引起FFN释放功能的突触囊泡内的特异性，可以直截了当地确定。不到15分钟的片FFN511暴露将导致在微弱的荧光信号，由于染料在码头的不足装载。在这个协议中，我们使用100微米ADVASEP - 7删除绑定到细胞外组织的染料。这一步是没有必要的，但如果它被省略，在学联的冲洗时间需要延长。总之，取决于您选择的准备，您将需要修改的浓度和装载期间，以确定最佳的标签。
Acknowledgments
D.萨麦斯感谢G.哈罗德和莱拉Y。马瑟斯慈善基金会和哥伦比亚大学科学与工程学院的倡议。
D.萨麦斯和D。苏尔寿感谢麦克奈特技术创新McKnight基金会在神经科学奖
D.苏尔寿感谢NIDA的，镍氢电池，和Picower和帕金森氏病的基础。
H.张感谢NARSAD。
相对湿度爱德华兹感谢迈克尔J.福克斯基金会，全国帕金森基金会，奈达和镍氢。
我们感谢罗伯特伯克技术支持与TIRF显微镜设置为6 - OHDA注射和建议，有益的讨论，Merek成像分析编程的小马克Sonders，和扬Schmoranzer。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Columbia University - Dalibor Sames Lab | ||
| ADVASEP-7 | CyDex | AR-OA7-005 | |
| RC-27L Recording chamber | Warner Instruments | 64-0375 | |
| PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation |
| Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI |
References
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
- Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
- Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).
