Summary
Een nieuwe manier om optisch te meten neurotransmissie met behulp van fluorescerende dopamine-analogen.
Abstract
Het zenuwstelsel zendt signalen tussen neuronen via neurotransmitters in de synaptische vesicles fusie. Te observeren neurotransmitter opname en afgifte van individuele presynaptische terminals direct, ontwierpen we fluorescerende valse neurotransmitters als substraten voor de synaptische vesicles monoamine transporter. Met behulp van deze probes om de afbeelding dopamine-afgifte in het striatum, maakten we verschillende opmerkingen die relevant zijn voor synaptische plasticiteit. We vonden dat de fractie van synaptische blaasjes het vrijgeven van neurotransmitters per stimulus is afhankelijk van de stimulus frequentie. Een kinetisch verschillende "reserve" synaptische vesicles bevolking werd niet waargenomen onder deze experimentele omstandigheden. Een frequentie-afhankelijke heterogeniteit van de presynaptische terminals werd onthuld dat afhankelijk was van een deel van D2 dopamine receptoren, duidt op een mechanisme voor het frequentie-afhankelijke coderen van presynaptische selectie.
Hui Zhang en Niko G. gubernator droegen ook voor dit werk.
Protocol
Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in gubernator et al.., Science 324 (5933). 1441-1444 (2009) .
1. Voorbereiden van acute striatale plakjes
- Alvorens acute striatale plakken, moet men zuurstof de kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ASCF) en met ijs koelen gedurende minstens 15 minuten voor de hersenen extractie. Houd de ACSF ijskoud en zuurstof tijdens de dissectie. ACSF (in mm): NaCl 125, KCl 2,5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2.4, MgSO4 1.3, KH 2 PO 4 0.3, glucose 10, HEPES 5, pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm.
- Onthoofden mannelijke muizen zonder verdoving.
- Extract van de hele hersenen van de muis, en monteer het op de vibratome lade gelegd op het gebruik van vibratome Krazy ® Glue. Brain-extractie en montage moet gebeuren binnen 2 minuten. Gedurende deze tijd, zorg ervoor dat de ACSF ijskoud te houden en zuurstof te houden het weefsel gezond.
- Snijd coronale striatale hersenen plakken op 250μm dikte van bregma +1,54 tot 0,62 1. Drie hele plakken zal worden verkregen, die vervolgens kan worden gesneden in 6 half plakjes met een naald.
- Incubeer de hersenen plakjes in zuurstofrijk ACSF bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor het laden probe. Slices scherm is goed FFN511 laden en blijven actief voor imaging tot 4 uur na de slice bereiding.
2. Het laden van FFN511
- Bereid FFN511 belasting-oplossing (10μM FFN511 in ACSF); ook voorbereiden op 100 urn ADVASEP-7 in ACSF. Alle oplossingen moeten vers worden bereid en ten minste 15 minuten zuurstof voorafgaand aan het laden in de plakjes.
- Individueel incubeer slice met FFN511 laden oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder vervolgens de kleurstof gebonden aan extracellulaire weefsel door het incuberen van de geladen slice in zuurstof 100 urn ADVASEP-7 ACSF gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur 2. Slices zijn nu klaar voor de beeldvorming.
3. Imaging FFN511 in de hersenen plakjes
Beeldvorming van FFN511 in de plakjes wordt uitgevoerd met behulp van multifoton laser scanning microscoop. We maken gebruik van een Prairie Ultima multifoton laser scanning microscoop (We waren met behulp van een Zeiss LSM 510 NLO multifoton laser scanning microscoop eerder en sommige resultaten werden verkregen met de Zeiss microscoop).
- Plaats de FFN511 geladen slice in de opname kamer (RC-27L, Warner) en superfuse met zuurstofrijk ACSF bij een debiet van 1-2 ml per minuut. Plaats dan een platina harp met nylon snaren op de top van de slice om beweging te minimaliseren tijdens het experiment. Om verder te minimaliseren beweging, kan de slice te stabiliseren ten minste 10 minuten in de kamer voorafgaand aan de beeldvorming.
- Visualiseer en zoek het dorsale striatum met heldere veld luminescentie onder een 10x water immersie objectief.
- Plaats en positie van de bipolaire twisted wolframelektroden in deze regio als het uitvoeren van een stimulatie experiment. De ideale beeldvorming gebied is gelegen binnen 300 micrometer tussen de twee uiteinden van de stimulerende bipolaire elektrode. Plaats deze regio in het centrum van het gezichtsveld.
- Image FFN511-gelabeld striatale terminals onder een 63x (0.9 NA) onderdompeling in water ultraviolet doelstelling. FFN511 is enthousiast bij 760 nm met een Mai Tai laser van Spectral Fysica en een optimale fluorescentie van striatale terminals is gezien door een band pass filter (480-520 nm). Beelden worden vastgelegd in 12-bit formaat met 75 x 75 micrometer regio's van de belangstelling op 512 x 512 pixel resolutie. Voor gestimuleerd ontkleuren experimenten is om te compenseren voor z-as shift, een Z-serie van 5-7 beelden, gescheiden door een urn in de z-vlak, verkregen voor elke periode.
4. FFN511 Ontkleuroplossing
De FFN511 label kan worden ontkleurd door een hoge concentratie van KCl (we gebruiken 70 mM KCl), (+)-amfetamine sulfaat (AMPH, 20 pM), of elektrische stimulatie. In de KCl ontkleuroplossing experiment, wanneer er een hoog kalium ACSF oplossing wordt aangebracht op de hersenen slice, de FFN511 label destains binnen 2 minuten. Record xyz-t beelden om FFN511 ontkleuren volgen in de tijd. Het volgende beschrijft elektrische stimulatie-afhankelijke dopamine terminal ontkleuren:
- Op te sporen FFN511 ontkleuren wordt na verloop van tijd, zijn xyz-t beelden opgenomen. Om ervoor te zorgen een minimale beweging van de slice (minder dan 4 micrometer in z-as) en geen fotobleken door de laser, de controle tijdreeksen beelden van de z-stack moet worden verkregen voor ten minste 5 minuten voor de stimulatie. Anders, past het laservermogen.
- Naar aanleiding van deze controle beelden, blijven de xyz-t imaging, terwijl de stimulatie start bij een frequentie van 1, 4 of 20 Hz. Prikkels op 1, 4 of 20 Hz (300 microseconden x 1 mA) worden toegepast op het striatum ter plaatse door een Iso-Flex stimulus isolator veroorzaakt door een Master-8 pulsgenerator (AMPI, Jeruzalem, Israël) met behulp van bipolaire elektroden. Te minimaliserende variatie in de depolarisatie van de introductie sites, hebben we gebruik gemaakt van een stimulatie protocol toe te passen 150% van de maximale stimulatie-intensiteit wordt bepaald door cyclische voltammetrie.
- Gebruik de juiste software voor beeldanalyse. In ons lab maken we gebruik van Image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) en op maat geschreven software in IDL (Research Systems, Boulder, CO) om de puncta fluorescentie en de veranderingen te kwantificeren met time3.
Represenative resultaten
Figuur 1 toont FFN511 het laden in het striatum slice is nu voltooid. Vertegenwoordiger van afbeeldingen met behulp van 10x en 60x objectief zijn weergegeven in figuur 1. De selectieve etikettering van dopamine-terminals kan worden ontkleurd met 20 uM amfetamine.
Figuur 2 toont ontkleuren van FFN511 etikettering door hoge KCl.
Figuur 3 toont ontkleuren van FFN511 etikettering door de lokale elektrische stimulatie.
Figuur 1 FFN511 labels dopamine terminals in live corticale-striatale acute plakken (A) Labeling door FFN511 in acute wonen corticale-striatale slice:.. Overvloedig etikettering in het striatum (STR), schaarser etikettering in de cortex (CTX), en geen label in corpus callosum (CC). Schaalbalk:. 100 micrometer (B) Ontkleuroplossing van FFN511 uit het striatum van amfetamine. Linker-panelen: voor amfetamine, rechts panelen: na 20 minuten van 20 uM amfetamine. Schaalbalk: 10 micrometer.
Figuur 2. Ontkleuroplossing van FFN511 etikettering door hoge KCl. FFN511 etikettering is ontkleurd binnen 2 minuten de toepassing van 70 mM KCl in ACSF. Schaalbalk: 10μm.
Figuur 3. Frequentie-afhankelijke ontkleuren van FFN511 etikettering in het striatum. (A) Lokale stimulatie op 4 Hz resulteerde in ontkleuren van de terminals. Stimulatie begon op t = 0. Schaal bar: 5 micrometer (B) Ontkleuroplossing van FFN511 op 4 Hz is Ca 2 + - en frequentie-afhankelijk.. Controls ontvangen geen stimulatie (153 puncta vanaf 3 plakjes). Ontkleuroplossing met cadmium chloride (200 uM) was identiek aan ongestimuleerde controles (475 puncta vanaf 5 plakjes). De ontkleuroplossing curves voor elke stimulatie frequentie geschikt waren door een exponentiële verval-functie en half-life (t 1 / 2) waarden berekend als τ x 0.693 (1 Hz: 765 puncta vanaf negen schijfjes, 4 Hz: 410 puncta van 7 plakjes, 20 Hz: 416 puncta vanaf 6 sneetjes). Verwijzen wij u naar de video microfoto van twee-foton microscopie van FFN511 ontkleuren tijdens exocytose in een striatale hersenen slice voorbereiding.
Discussion
In deze video, demonstreren we een methode om optisch te visualiseren neurotransmissie met behulp van fluorescerende dopamine-analogen. FFN511 is de eerste generatie FFNs we hebben ontwikkeld. Hoewel het werd ontworpen door zich te richten de neuronale vesiculaire monoamine transporter (VMAT2) die monoamine neurotransmitters draagt vanuit het cytoplasma naar synaptische blaasjes, en in het bijzonder labels dopamine terminals in het striatum en de vermoedelijke catecholamine en / of serotonine terminals in de cortex (zoals in de wetenschap papier), een passende oplaadfase is van cruciaal belang voor de specificiteit, omdat FFN511 relatief hydrofoob. Wij vonden dat incubatie langer dan 40 minuten zal resulteren in een uitgebreide niet-specifieke kleuring in striatale plakjes. De specificiteit kan gewoon worden bepaald door ontkleuren wordt het gebruik van een hoge concentratie van KCl, waarvan de release van FFN zou ervoor moeten zorgen binnen de functionele synaptische blaasjes. Blootstelling van de slice om FFN511 voor minder dan 15 minuten zal resulteren in een zwak fluorescerende signaal als gevolg van onvoldoende laden van de kleurstof in de terminals. In dit protocol gebruiken we 100 urn ADVASEP-7 aan de kleurstof gebonden aan extracellulaire weefsel te verwijderen. Deze stap is niet noodzakelijk, maar als het wordt weggelaten, de wash-out tijd in ACSF dient te worden verlengd. Samengevat, afhankelijk van de voorbereiding die u kiest, moet u de concentratie en het laden periode te wijzigen om een optimale etikettering vast te stellen.
Acknowledgments
D. Sames bedankt de G. Harold & Leila Y. Mathers Charitable Foundation en de Universiteit van Columbia initiatieven in Science and Engineering.
D. Sames en D. Sulzer dank de McKnight Foundation for The McKnight technologische innovaties in Neuroscience Award
D. Sulzer dankzij NIDA, NIMH, en de Picower en de ziekte van Parkinson stichtingen.
H. Zhang bedankt NARSAD.
RH Edwards bedankt de Michael J. Fox Foundation, de National Parkinson Foundation, NIDA en NIMH.
Wij danken Robert Burke voor 6-OHDA injecties en advies, Mark Sonders voor nuttige discussie, Merek Siu voor beeldvorming analyse programmering, en Jan Schmoranzer voor technische ondersteuning bij de TIRF microscopie setup.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Columbia University - Dalibor Sames Lab | ||
| ADVASEP-7 | CyDex | AR-OA7-005 | |
| RC-27L Recording chamber | Warner Instruments | 64-0375 | |
| PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation |
| Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI |
References
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
- Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
- Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).
