Summary
Ett nytt sätt att mäta neurotransmission optiskt med fluorescerande dopamin-analoger.
Abstract
Nervsystemet sänder signaler mellan nervceller via frisättningen av neurotransmittorer under synaptiska vesikler fusion. För att observera neurotransmittor upptag och utsläpp från enskilda presynaptiska terminalerna direkt utformade vi fluorescerande falska signalsubstanser som substrat för det synaptiska vesikler MAO transportör. Med hjälp av dessa sonder till bild dopaminfrisättning i striatum, gjorde vi flera observationer relevanta för synaptisk plasticitet. Vi fann att den del av synaptiska vesikler frigöra signalsubstansen per stimulans var beroende av stimulans frekvens. En kinetiskt distinkt "reserv" synaptiska vesikler befolkningen har inte observerats under dessa experimentella förhållanden. En frekvens-beroende heterogenitet presynaptiska terminaler avslöjades att var beroende dels på D2 dopaminreceptorer, vilket indikerar en mekanism för frekvensberoende kodning av presynaptiska urval.
Hui Zhang och Niko G. Gubernator bidragit lika för detta arbete.
Protocol
Denna metod användes i forskningen redovisas i Gubernator et al. Science 324 (5933). 1441-1444 (2009) .
1. Förbereda akut striatum skivor
- Innan du förbereder akut striatala skivor, måste man syresätta den konstgjorda cerebrospinalvätskan (ASCF) och kyla den med is i minst 15 minuter innan hjärnan utvinning. Håll ACSF iskall och syresatt under dissekering. ACSF (i mm): NaCl 125, KCl 2,5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2,4, MgSO4 1,3, KH 2 PO 4 0,3, glukos 10, HEPES 5, pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm.
- Halshugga hanmöss utan bedövning.
- Utdrag hela hjärnan från mus och montera den på vibratome brickan placeras på vibratome med Krazy ® lim. Brain utvinning och montering ska ske inom 2 minuter. Under denna tid, se till att hålla ACSF iskall och syresätts för att hålla vävnaden frisk.
- Skär koronalt striatala hjärnan skivor på 250μm tjocklek mellan bregma 1,54 till 0,62 1. Tre hela skivor kommer att erhållas som sedan kan skäras i 6 halv skivor med en nål.
- Inkubera hjärnan skivor i syresatt ACSF i rumstemperatur i minst 1 timme före sond lastning. Slices visa goda FFN511 lastning och vara aktiv för avbildning upp till 4 timmar efter skiva beredning.
2. Laddar FFN511
- Förbered FFN511 lastning lösning (10μM FFN511 i ACSF), också förbereda 100μM ADVASEP-7 i ACSF. Alla lösningar skall beredas och syresätts i minst 15 minuter innan de lastas in i skivor.
- Individuellt inkubera skiva med FFN511 lastning lösningen i 30 minuter i rumstemperatur.
- Ta sedan bort färgen bundna till extracellulära vävnaden genom inkubering av laddade slice i syresatt 100μM ADVASEP-7 ACSF i 30 minuter i rumstemperatur 2. Segment är nu redo för avbildning.
3. Imaging FFN511 i hjärnan skivor
Avbildning av FFN511 i skivor utförs med hjälp multiphoton laserskanning mikroskop. Vi använder en Prairie Ultima multiphoton laserskanning mikroskop (Vi använde ett Zeiss LSM 510 NLO multiphoton laserskanning mikroskop tidigare och några resultat erhölls med Zeiss mikroskop).
- Placera FFN511-laddad skiva i inspelningen kammaren (RC-27L, Warner) och superfuse med syresatt ACSF med en flödeshastighet av 1-2 ml per minut. Placera därefter en platina harpa med nylonsträngar ovanpå slice för att minimera rörelser under experimentet. För att ytterligare minimera rörelse, låta slice att stabilisera i minst 10 minuter i kammaren före avbildning.
- Visualisera och lokalisera dorsala striatum med ljusa fält luminiscens under en 10x nedsänkning i vatten mål.
- Plats och placera bipolär vriden volframelektroder i denna region om du utför en stimulering experiment. Den idealiska avbildning Området ligger inom 300 mikrometer i mellan de två topparna av stimulerande bipolära elektroden. Placera denna region i centrum av synfältet.
- Bild FFN511-märkta striatala terminaler inom en 63x (0,9 NA) nedsänkning i vatten ultraviolett mål. FFN511 är upphetsad vid 760 nm med en Mai Tai laser från Spectral fysik och optimal fluorescens striatala terminaler ses genom ett bandpassfilter (480-520 nm). Bilderna är tagna i 12-bitars format med 75 x 75 ìm områden av intresse på 512 x 512 pixlar. För stimuleras avfärgning experiment, är att kompensera för z-axeln skift, ett z-serie på 5-7 bilder, separerade med 1 mikrometer i z-planet, erhålls för varje tidsperiod.
4. FFN511 Avfärgning
Den FFN511 Etiketten kan destained antingen genom hög koncentration av KCl (vi använder 70 mm KCl), (+)-amfetamin sulfat (AMPH, 20 M), eller elektrisk stimulering. I KCl avfärgning experimentet, då en hög kalium ACSF lösning tillämpas på hjärnan skiva, den FFN511 etiketten destains inom 2 minuter. Spela in xyz-t bilder för att spåra FFN511 avfärgning över tiden. Nedan beskrivs elektrisk stimulering-beroende avfärgning dopamin terminalen:
- För att spåra FFN511 avfärgning över tid, är XYZ-t bilder inspelade. För att säkerställa minimal rörelse av skiva (mindre än 4 nm i z-axel) och ingen fotoblekning av laser, serien kontroll tiden bilder av z-stack bör inhämtas i minst 5 minuter före stimulering. Annars justera lasern makten.
- Efter dessa kontroll bilder, fortsätta xyz-t avbildning medan starta stimuleringen vid frekvenser på 1, 4 eller 20 Hz. Stimuli vid 1, 4 eller 20 Hz (300 ìs x 1 mA) tillämpas till striatum lokalt genom ett Iso-Flex stimulans isolator utlöses av en master-8 pulsgenerator (Ampi, Jerusalem, Israel) med bipolär elektroder. För att minimeravariationen i depolarisation för övergång sajter har vi använt en stimulering protokoll som tillämpar 150% av maximal stimulering intensitet bestäms av cykliska voltammetry.
- Använd rätt programvara för bildanalys. I vårt labb använder vi Image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) och anpassade skriven mjukvara i IDL (Research Systems, Boulder, CO) för att kvantifiera puncta fluorescens och förändringarna med time3.
Represenative Resultat
Figur 1 visar FFN511 lastning i striatum skiva är nu klar. Representativa bilder med 10x och 60x objektiv visas i Fig.1. Den selektiva märkning av dopamin terminaler kan destained med 20 mikroM amfetamin.
Figur 2 visar avfärgning av FFN511 märkning av hög KCl.
Figur 3 visar avfärgning av FFN511 märkning av lokala elektrisk stimulering.
Figur 1 FFN511 etiketter dopamin terminaler i levande kortikala-striatala akut skivor (A) märkning av FFN511 vid akut lever kortikala-striatala slice:.. Rikligt märkning i striatum (STR), glesare märkning i cortex (CTX), och ingen etikett i corpus callosum (CC). Skala bar:. 100 ìm (B) Avfärgning av FFN511 från striatum av amfetamin. Vänster panel: före amfetamin, höger sida: efter 20 minuter av 20 mikroM amfetamin. Skala bar: 10 mikrometer.
Figur 2. Avfärgning av FFN511 märkning av hög KCl. FFN511 märkning destained inom 2 minuter tillämpning av 70 mM KCl i ACSF. Skala bar: 10μm.
Figur 3. Frekvensberoende avfärgning av FFN511 märkning i striatum. (A) Lokal stimulering vid 4 Hz resulterade i avfärgning från terminalerna. Stimulering började vid t = 0. Skala bar: 5 ìm (B) Avfärgning av FFN511 vid 4 Hz Ca 2 + - och frekvensberoende.. Kontroller fått någon stimulering (153 puncta från 3 skivor). Avfärgning med kadmiumklorid (200 M) var identisk med ostimulerade kontroller (475 puncta från 5 skivor). Den avfärgning kurvorna för varje stimulering frekvens var passande med en enda exponentiellt avtagande funktion och halveringstid (t 1 / 2) värden beräknas som τ x 0,693 (1 Hz: 765 puncta från 9 skivor, 4 Hz: 410 puncta från 7 skivor, 20 Hz: 416 puncta från 6 skivor). Se videon mikroskop från 2-foton mikroskopi av FFN511 avfärgning under exocytos i striatum hjärnan bit beredning.
Discussion
I denna video visar vi en metod för att visualisera neurotransmission optiskt med fluorescerande dopamin-analoger. FFN511 är den första generationen av FFNS vi har utvecklat. Även om det var designad av inriktning på neuronala vesikulär MAO transportör (VMAT2) som bär monoaminoneurotransmittorer från cytoplasman in i synaptiska vesikler, och särskilt etiketter dopamin terminaler i striatum och förmodade katekolamin och / eller terminaler serotonin i cortex (som visas i Science papper), är en lämplig lastning tid avgörande för specificiteten eftersom FFN511 är relativt hydrofoba. Vi fann att inkubationstiden längre än 40 minuter kommer att resultera i omfattande icke-specifik färgning i striatum skivor. Specificiteten kan bli lätt bestämmas genom avfärgning med en hög koncentration av KCl, som bör orsaka utsläpp av FFN inom funktionella synaptiska blåsor. Exponering av slice till FFN511 för mindre än 15 minuter kommer att resultera i en svag fluorescerande signal på grund av otillräcklig lastning av färgen i terminalerna. I detta protokoll använder vi 100μM ADVASEP-7 för att ta bort färgen bunden till extracellulär vävnad. Detta steg är inte nödvändigt, men om det utelämnas, måste wash-out tid i ACSF förlängas. Sammanfattningsvis, beroende på förberedelserna du väljer, måste du ändra koncentrationen och lastning tid för att bestämma optimal märkning.
Acknowledgments
D. Sames tackar G. Harold & Leila Y. Mathers Charitable Foundation och Columbia University initiativ inom vetenskap och teknik.
D. Sames och D. Sulzer tacka McKnight fonden för McKnight tekniska innovationer i neurovetenskap Award
D. Sulzer tack Nida, NiMH och Picower och Parkinsons stiftelser sjukdom.
H. Zhang tack NARSAD.
RH Edwards tackar Michael J. Fox Foundation, National Parkinsons Foundation, Nida och NiMH.
Vi tackar Robert Burke för 6-OHDA injektioner och råd, Mark Sonders för användbara diskussion, Merek Siu för bildanalys programmering, och Jan Schmoranzer för teknisk support med TIRF mikroskopi setup.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Columbia University - Dalibor Sames Lab | ||
| ADVASEP-7 | CyDex | AR-OA7-005 | |
| RC-27L Recording chamber | Warner Instruments | 64-0375 | |
| PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation |
| Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI |
References
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
- Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
- Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).
