Summary
Yeni bir floresan dopamin analogları kullanarak optik nörotransmisyon ölçmek anlamına gelir.
Abstract
Sinir sistemi nöronlar arasındaki sinaptik vezikül füzyon sırasında nörotransmiter bülteni ile sinyalleri iletir. Nörotransmitter alımı ve doğrudan bireysel presinaptik terminallerden serbest gözlemlemek için, floresan yanlış nörotransmitterlerin sinaptik vezikül monoamin taşıyıcı yüzeylerde olarak tasarlanmıştır. Striatum görüntü dopamin serbest bırakmak için bu problar kullanarak, sinaptik plastisite ile ilgili çeşitli gözlemler yapmıştır. Biz uyaran ortalama serbest nörotransmitter sinaptik veziküllerin kesir uyaran frekansı bağımlı olduğu bulundu. Bu deneysel koşullar altında kinetik farklı bir "rezerv" sinaptik vezikül nüfus gözlenmemiştir. Presinaptik terminallerin bir frekans bağımlı heterojenite presinaptik seçim frekans bağımlı kodlama için bir mekanizma gösteren, D2 dopamin reseptörlerine parçası bağımlı ortaya çıktı.
Hui Zhang ve Niko G. Gubernator bu iş için eşit olarak katkıda bulundu.
Protocol
Bu yöntem bildirilen araştırma Gubernator ve ark, Bilim 324 (5933). 1441-1444 (2009) .
1. Akut striatal dilim hazırlanması
- Akut striatal dilim hazırlamadan önce, bir oksijen yapay beyin omurilik sıvısı (ASCF) ve önce beyin çıkarımı için en az 15 dakika boyunca buz ile soğuk olmalıdır. ACSF buz tutun ve diseksiyon sırasında oksijenli. ACSF (mM): NaCl 125, 2.5 KCl, NaHCO 3 26, CaCl 2 2.4 MgSO4 1.3, KH 2 PO 4 0.3, glukoz 10, Hepes 5; pH 7,3-7,4 290-295 mOsm.
- Anestezi olmadan erkek fare başını kesmek.
- Fare tüm beyin ayıklayın ve Krazy ® Yapıştırıcı kullanarak vibratome yerleştirilen vibratome tepsi üzerine monte. Beyin çıkarma ve montajı, 2 dakika içinde yapılmalıdır. Bu süre zarfında, ACSF buz tutmak ve doku sağlıklı tutmak için oksijenli emin olun.
- Bregma 1,54 arasında 0,62 1 250μm kalınlığında koronal striatal beyin dilimleri kesin. Üç bütün dilimleri daha sonra bir iğne ile 6 yarım dilimler halinde kesilmiş olabilir elde edilecektir.
- Prob yüklemeden önce en az 1 saat oda sıcaklığında oksijenli ACSF beyin dilimleri inkübe edin. Dilimler iyi FFN511 yükleme ekranı ve 4 saat sonra görüntüleme dilim hazırlanması için aktif kalır.
2. FFN511 Yükleniyor
- FFN511 yükleme solüsyonu (içinde 10μM FFN511 ACSF) hazırlayın; ACSF içinde ADVASEP-7 100μM hazırlamak. Tüm çözümler taze olarak hazırlanır ve en az 15 dakikalık dilimler halinde yüklemeden önce oksijenli olmalıdır.
- Bireysel dilim FFN511 yükleme çözümü ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Sonra oksijenli 100μM ADVASEP-7 ACSF yüklenen dilim az 30 dakika oda sıcaklığında 2 kuluçka ekstraselüler dokuya bağlı boya çıkarın. Dilimler görüntüleme için hazırız.
3. Görüntüleme FFN511 beyin dilimleri
Dilimleri görüntüleme FFN511 multiphoton lazer tarama mikroskobu kullanılarak yapılır. Biz Prairie Ultima multiphoton lazer tarama mikroskop kullanılarak (Biz daha önce bir Zeiss LSM 510 NLO multiphoton lazer tarama mikroskobu kullanılarak ve Zeiss mikroskop ile bazı sonuçlar elde edilmiştir).
- Kayıt odasında FFN511 yüklü dilim (RC-27L, Warner) yerleştirin ve bir akış hızı dakikada 1-2 ml az oksijenli ACSF superfuse. Sonra deney sırasında hareketini en aza indirmek için, dilimin üstüne naylon dizeleri ile platin arp yerleştirin. Hareketi daha da en aza indirmek için, dilim odasında en az 10 dakika önce görüntüleme stabilize olması için izin verir.
- Görselleştirin ve 10x suya daldırma hedefi altında parlak bir alan lüminesans dorsal striatum bulmak.
- Yeri ve konumu bu bölgede bipolar bükülmüş tungsten elektrot stimülasyon deneyi gerçekleştirmek durumunda. Iki uyarıcı bipolar elektrot uçları arasındaki 300 mikron ideal görüntüleme alanının içinde yer almaktadır. Görme alanının merkezinde bu bölgeye yerleştirin.
- Resim FFN511 bir 63x (0.9 NA) su altında kalacak ultraviyole amacı altında striatal terminalleri etiketli. FFN511 Spektral Fizik ve striatal terminalleri optimal floresan Mai Tai lazer 760 nm dalga boyunda bir bant geçiren filtre (480-520 nm) ile görülür heyecanlı. Görüntüler, 12-bit formatında 512 x 512 piksel çözünürlük faiz 75 x 75 mikron bölgeleri ile yakalanır. Uyarılmış destaining deneyler için, z-düzleminde 1 mikron ayrılmış z-eksen kayması, 5-7 görüntüleri z serisi, telafi etmek için her dönem için elde edilir.
4. FFN511 Destaining
FFN511 etiket KCl (70 mM KCl) yüksek konsantrasyon (+) amfetamin sülfat (AMPH, 20 mcM), ya da elektrik stimülasyonu ya destained olabilir. Yüksek potasyum ACSF çözüm beyin dilim uygulanır KCl destaining deney, 2 dakika içinde FFN511 etiket destains. Tutanak xyz-t görüntüleri zaman içinde destaining FFN511 izlemek için. Aşağıdaki elektrik stimülasyonu-bağımlı dopamin terminali destaining açıklar:
- Zamanla FFN511 destaining izlemek için, xyz-t görüntüleri kaydedildi. Dilim (z-ekseninde az 4 mm) en az hareket sağlamak için ve hiçbir z yığının lazer, kontrol zaman serisi görüntüleri photobleaching stimülasyon öncesinde en az 5 dakika süreyle alınmalıdır. Aksi takdirde, lazer gücü ayarlayın.
- 1 frekansları, 4 ya da 20 Hz uyarılmaya başlanması ise bu kontrol görüntülerinin ardından, xyz-t görüntüleme devam etmektedir. 1, 4 veya 20 Hz (300 μs x 1 mA) Uyaranlar bipolar elektrotlar kullanarak Master-8 darbe jeneratörü (Ampi, Kudüs, İsrail) tarafından tetiklenen bir Iso-Flex uyaran izolatör yerel striatum uygulanır. En aza indirmek içinserbest sitelerin depolarizasyon varyasyonu, siklik voltametri tarafından belirlenen maksimal stimülasyon yoğunluğu% 150 uygulama stimülasyon protokolü kullanılır.
- Görüntü analiz için uygun yazılımı kullanın. Bizim laboratuvarda, biz IDL Görüntü J (Wayne Rosband, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Rockville, MD) ve özel yazılmış yazılımlar (Araştırma Sistemleri, Boulder, CO) Süresi3 puncta floresan ve değişiklikleri ölçmek için kullanın.
Represenative Sonuçlar
Şekil 1 striatal dilim içine FFN511 yükleme işlemi tamamlandıktan gösterir. 10x ve 60x objektif kullanarak Temsilcisi görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Dopamin terminalleri seçici etiketleme 20 mcM amfetamin destained olabilir.
Yüksek KCl FFN511 etiketleme destaining Şekil 2 göstermektedir.
Şekil yerel elektrik stimülasyonu ile etiketleme FFN511 destaining 3 gösterir.
Şekil 1 canlı kortikal-striatal akut dilim FFN511 etiketler dopamin terminalleri (A) akut kortikal-striatal canlı dilim FFN511 Etiketleme:. Striatum bol etiketleme (STR), korteks seyreldiğinde etiketleme (CTX) ve herhangi bir etiket korpus kallozum (CC). Ölçek çubuğu: 100 mm (B) Destaining amfetamin tarafından striatum FFN511 Sol paneller: amfetamin önce sağ panelleri: 20 mcM amfetamin 20 dakika sonra. Ölçek çubuğu: 10 mm.
Şekil 2 yüksek KCl FFN511 etiketleme Destaining. FFN511 etiketleme ACSF 2 dk 70 mM KCl uygulama içinde destained. Ölçek çubuğu: 10μm.
Şekil 3 striatumda FFN511 etiketleme Frekans bağımlı destaining (A) 4 Hz Yerel uyarılması terminallerinden destaining sonuçlandı. Uyarım t = 0 'da başladı. Ölçek çubuğu: 5 mikron (B) 4 Hz az FFN511 Destaining Ca 2 + ve frekans bağımlı. Kontroller hiçbir stimülasyonu (3 dilim 153 puncta) aldı. Kadmiyum klorür (200 mcM) ile Destaining unstimulated denetimleri (5 dilim 475 puncta) aynıydı. Olarak hesaplanan değerler her bir uyarımı frekans için destaining eğrileri tek bir üstel bozulma fonksiyonu ve yarılanma ömrü (t 1 / 2) uygun τ x 0.693 (1 Hz: 9 dilimleri, 4 Hz 765 puncta: 7 dilim 410 puncta 20 Hz: 6 dilim) 416 puncta. Striatal beyin dilim hazırlık ekzositoz sırasında FFN511 destaining 2-foton mikroskopi video mikrografı bakın.
Discussion
Bu video, floresan dopamin analogları kullanarak optik nörotransmisyon görselleştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. FFN511 FFNs ilk nesil biz geliştirdik. Bilim gösterildiği gibi sinaptik veziküller içine sitoplazma monoamin nörotransmitterler taşır ve özellikle korteks, striatum ve varsayılan katekolamin ve / veya serotonin terminal dopamin terminalleri etiketler nöronal veziküler monoamin taşıyıcı (VMAT2) (hedefleyerek tasarlanmış olmasına rağmen FFN511 nispeten hidrofobik olduğundan kağıt), uygun bir yükleme süresi özgüllük için kritik öneme sahiptir. Biz 40 dakika daha uzun kuluçka striatal dilimleri geniş nonspesifik boyanma neden olacaktır bulundu. Özgüllüğü ve sade bir dille, fonksiyonel sinaptik veziküller içinde FFN serbest bırakılması neden KCl yüksek bir konsantrasyon ile destaining tespit edilebilir. Az 15 dakika süreyle FFN511 dilim Pozlama terminallerde boya yetersiz yükleme nedeniyle zayıf floresan sinyal neden olur. Bu protokol, ekstrasellüler doku bağlı boya kaldırmak için 100μM ADVASEP-7. Bu adım gerekli değildir, ancak belirtilmezse, ACSF içinde arınma süresi uzamış olması gerekir. Özetle, seçtiğiniz hazırlanmasına bağlı olarak, en iyi etiketleme belirlemek için konsantrasyon ve yükleme süresini değiştirmek için ihtiyacınız olacak.
Acknowledgments
D. Şemeş G. Harold & Leila Y. Vakfı ve Columbia Üniversitesi Fen ve Mühendislik Girişimleri Mathers teşekkürler.
D. Şemeş ve D. Sulzer Nörobilim Ödülü McKnight Teknolojik Yenilikler McKnight Vakfı teşekkür
D. Sulzer NIDA, NIMH ve Picower ve Parkinson Hastalığı Vakıflar teşekkürler.
H. Zhang sayesinde NARSAD.
RH Edwards, Michael J. Fox Vakfı, Ulusal Parkinson Vakfı, NIDA ve NIMH teşekkürler.
6-OHDA enjeksiyonları ve tavsiyeleri, yararlı tartışma, görüntüleme analiz programlama için Merek Siu Mark Sonders ve Jan Schmoranzer Robert Burke TIRF mikroskopi kurulum, teknik destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Columbia University - Dalibor Sames Lab | ||
| ADVASEP-7 | CyDex | AR-OA7-005 | |
| RC-27L Recording chamber | Warner Instruments | 64-0375 | |
| PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation |
| Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI |
References
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
- Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
- Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).
