Summary
새로운 형광 도파민의 analogs를 사용하여 광학 neurotransmission을 측정하는 것을 의미합니다.
Abstract
신경계는 시냅스 소포의 융합 동안 신경 전달 물질 방출을 통해 뉴런 사이의 신호를 전송합니다. 신경 전달 물질의 이해와 직접 개별 presynaptic 터미널에서 릴리스를 관찰하기 위해, 우리는 시냅스 소포 모노 아민 전송을위한 기판으로 형광 잘못된 신경 전달 물질을 설계했습니다. striatum의 이미지 도파민 릴리스 이러한 프로브를 사용하여, 우리는 시냅스 소성에 관련 몇 가지 관찰을했다. 우리는 자극마다 신경 전달 물질을 방출하는 시냅스 vesicles의 분율이 자극 주파수에 의존 것으로 나타났습니다. kinetically 별개 "예약"시냅스 소포 인구는 이러한 실험 조건 하에서 관찰되지 않았습니다. presynaptic 터미널의 주파수 종속 이질은 그 presynaptic 선택의 주파수 의존 코딩을위한 메커니즘을 나타내는 D2 도파민 수용체에 부분적으로 의존했다 발표했다.
휘 장 및 니코 G.의 Gubernator이 작품에 동등하게 공헌했습니다.
Protocol
이 방법에 보고된 연구에 사용된 Gubernator 외., 과학 324 (5933)가. 1441년부터 1444년까지 (2009) .
1. 급성 striatal 조각 준비
- 급성 striatal 조각을 준비하기 전에, 하나는 산소 인공 뇌척수 (ASCF) 사전 뇌 추출에 적어도 15 분 동안 얼음으로 진정해야합니다. ACSF의 얼음 추위를 유지하고 해부하는 동안 산소. ACSF (MM 년) : NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2.4, MgSO4 1.3, KH 2 PO 4 0.3, 포도당 10, HEPES 5; 산도 7.3-7.4, 290-295 mOsm.
- 마취없이 남성 마우스 목을 벨.
- 마우스의 전체 두뇌를 추출하고, Krazy ® 접착제를 사용하여 vibratome에 게재 vibratome 트레이에 탑재합니다. 브레인 추출 및 설치 2 분 이내에 이루어져야합니다. 이 시간 동안 ACSF 얼음 추위를 유지하고 조직의 건강을 유지하기 위해 산소를해야합니다.
- bregma 1.54 사이에 0.62 1 250μm 두께 코로나 striatal 뇌의 슬라이스 컷. 세 전체 조각은 다음 바늘 6 개 반 조각으로자를 수있는 얻을 것입니다.
- 프로브 로딩하기 전에 최소한 1 시간 동안 실온에서 산소 ACSF의 뇌 조각 품어. 조각은 좋은 FFN511 로딩 표시하고 슬라이스 준비 후 최대 4 시간까지 이미징 대해서는 운영중 상태로 유지됩니다.
2. FFN511를 로딩
- FFN511 로딩 솔루션 (ACSF에 10μM FFN511) 준비, 또한 ACSF에 ADVASEP - 7 100μM 준비합니다. 모든 솔루션은 신선한 사전 자른에 로딩하기 위해 적어도 15 분 산소해야합니다.
- 개별적으로 실온에서 30 분 FFN511 로딩 솔루션 슬라이스를 품어.
- 그런 다음 실온 2 30 분 산소 100μM ADVASEP - 7 ACSF에 로드된 슬라이스를 잠복기에 의해 세포 조직 바운드 염료를 제거합니다. 조각은 이제 영상에 대한 준비가되어 있습니다.
3. 뇌 조각의 영상 FFN511
조각에 FFN511의 영상은 multiphoton 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수행됩니다. 우리는 (우리는 이전 자이스 혈구 LSM 510 NLO multiphoton 레이저 스캐닝 현미경을 사용되었으며 어떤 결과가 자이스 혈구 현미경으로 획득했다) 프레리 울티마 multiphoton 레이저 스캐닝 현미경을 사용하고 있습니다.
- 레코딩 챔버에서 FFN511 - 로드된 슬라이스 (RC - 27L, 워너)을 놓고 분당 1-2 ML의 흐름 속도와 산소 ACSF superfuse. 그런 다음 실험 기간 동안 움직임을 최소화하기 위해 조각 위에 나일론 스트링과 플래티넘 하프를 놓으십시오. 추가 움직임을 최소화하려면 슬라이스가 이전에 영상으로 챔버에 적어도 10 분 동안 안정 수 있습니다.
- 시각화 및 10X 물 침지 목표 아래 명시야 발광와 지느러미 striatum을 찾습니다.
- 이 지역의 장소와 위치 바이폴라 꼬인 텅스텐 전극 자극 실험을 수행하는 경우. 이상적인 이미징 영역은 자극 양극성 전극의 두 팁 사이에 300 μm의 사이에 위치하고 있습니다. 시야의 중심이 지역에 놓으십시오.
- 이미지 FFN511 -라는 63x (0.9 NA) 물 침지 자외선 목표 아래 striatal 터미널. FFN511는 밴드 패스 필터 (480-520 nm의)를 통해 볼 수 있습니다 스펙트럼 물리 striatal 터미널 최적의 형광에서 마이 타이 레이저 760 nm의에 흥분됩니다. 이미지는 512 X 512 픽셀 해상도로 관심의 75 X 75 μm의 영역을 12 비트 형식으로 캡처됩니다. 자극 destaining 실험은 Z - 비행기 1 μm의로 구분하여 Z 축 이동 5-7 이미지의 Z - 시리즈에 대한 보상은 각 기간 동안 얻을 수 있습니다.
4. FFN511 Destaining
FFN511 레이블은 KCl 높은 농도 (우리 70 MM KCl을 사용하여), (+) - 암페타민 황산염 (AMPH, 20 μm의), 또는 전기적 자극에 의해 어느 destained 수 있습니다. 에 높은 칼륨의 ACSF 솔루션 두뇌 슬라이스에 적용됩니다 KCl destaining 실험, 2 분 이내 FFN511 레이블 destains. 기록은 XYZ - T의 이미지를 시간의 경과에 FFN511 destaining을 추적할 수 있습니다. 다음은 전기 자극에 의존 도파민 터미널 destaining 설명 :
- 시간이 지남에 따라 FFN511 destaining를 추적하려면, XYZ - T의 이미지가 기록됩니다. 슬라이스의 최소한의 움직임을 (Z 축 미만 4 μm의)되도록하려면없고, Z - 스택의 레이저, 제어 시간 시리즈 이미지로 photobleaching이 자극하기 전에 최소한 5 분 취득해야합니다. 그렇지 않으면, 레이저 파워를 조정합니다.
- 1 주파수, 4 또는 20 Hz에서에서 자극을 시작하면서 이러한 컨트롤 이미지에 따라 XYZ - T의 이미지를 계속합니다. 1, 4 또는 20 Hz에서 (300 μs X 1mA)의 자극은 양극성 전극을 사용하여 마스터 - 8 펄스 발생기 (AMPI, 예루살렘, 이스라엘)을 계기로 ISO - 플렉스 자극 아이 솔 레이터에 의해 로컬 striatum에 적용됩니다. 최소화하기 위해릴리스 사이트의 탈분극의 변화, 우리는 주기적 voltammetry에 의해 결정 최대한의 자극 강도의 150 %를 적용 자극 프로토콜을 사용하고 있습니다.
- 이미지 분석을위한 적절한 소프트웨어를 사용합니다. 우리가 실험실에서, 우리는 번이나로 puncta 형광 및 변경 사항을 수치 IDL의 이미지 J (웨인 Rosband, 건강의 국립 연구소, 락빌, MD) 및 사용자 정의 작성된 소프트웨어 (연구 시스템, 볼더, CO)을 사용합니다.
Represenative 결과
그림 1은 striatal 슬라이스에 FFN511로드 지금 완료 보여줍니다. 10X 및 60x 목표를 사용하는 대표 이미지는 Fig.1에 표시됩니다. 도파민 단말기의 선택적 라벨링는 20 μm의의 암페타민에 의해 destained 수 있습니다.
높은 KCl에 의해 FFN511 라벨링의 destaining 그림 2 보여줍니다.
지역 전기적 자극에 의해 FFN511 라벨링의 destaining 3 쇼 그림.
그림 1 라이브 피질 - striatal 급성 조각에 FFN511 라벨 도파민 터미널 (A) 급성 라이브 피질 - striatal 통에 FFN511하여 레이블 :.. striatum에서 풍부한 라벨 (STR), 피질에서 sparser 라벨 (CTX), 그리고 노 레이블 코퍼스의 callosum (CC). 스케일 바. 100 μm의 암페타민에 의해 striatum에서 FFN511의 (B) Destaining. 왼쪽 패널 : 전에 암페타민, 오른쪽 패널 : 20 μm의의 암페타민 20 분 후. 스케일 바 : 10 μm의.
그림 2. 높은 KCl에 의해 FFN511 라벨의 Destaining. FFN511 라벨이 ACSF 70 MM KCl 2 분 응용 프로그램 내에서 destained입니다. 스케일 바 : 10μm.
그림 3. striatum에서 FFN511 라벨링의 주파수 의존 destaining가. (A) 4 Hz에서 현지 자극은 터미널에서 destaining 결과. 자극은 t = 0에서 시작되었다. 스케일 바 : 5 μm의 (B) 4 Hz에서에서 FFN511의 Destaining은 칼슘 2 + - 및 주파수 의존.. 컨트롤이 더 자극 (3 조각에서 153 puncta)를받지 않습니다. 카드뮴 염화물 (200 μm의)와 Destaining 것은 unstimulated 컨트롤 (5 조각에서 475 puncta)로 동일했습니다. 로 계산 값은 각각의 자극 주파수에 대한 destaining 곡선은 하나의 지수 감쇠 함수와 반감기 (T 1 / 2)에 의해 맞는 τ X 0.693 (1 Hz에서 : 9 조각, 4 Hz에서에서 765 puncta : 7 조각에서 410 puncta, 20 Hz에서 6 조각)에서 416 puncta. striatal 두뇌 슬라이스 준비 exocytosis 동안 FFN511 destaining의 2 광자 현미경에서 비디오 현미경을 참조하십시오.
Discussion
이 비디오에서는, 우리는 형광 도파민의 analogs를 사용하여 광학 neurotransmission을 시각화하는 방법을 보여줍니다. FFN511 우리가 개발한 FFNs의 첫 세대입니다. 그것은으로 과학에 나타난 시냅스 vesicles로 세포질에서 모노 아민 신경 전달 물질을 실시하고, 특히 피질의 striatum 및 추정 카테 및 / 또는 세로토닌 터미널에서 도파민 터미널 레이블의 연결 기공을 갖는 모노 아민 전송기 (VMAT2)를 (대상으로 설계되었지만 FFN511 상대적으로 소수성이기 때문에 종이), 적절한 로딩 기간은 특이성을 위해 중요합니다. 우리는 그 40 분 이상을위한 인큐베이션은 striatal 조각의 광범위한 특이 현상이 얼룩집니다 발견했습니다. 특이성은 straightforwardly 기능 시냅스 vesicles 이내 FFN의 출시를 일으킬해야 KCl의 높은 농도를 사용 destaining에 의해 결정하실 수 있습니다. 미만 15 분 FFN511하는 슬라이스의 노출은 터미널에있는 색소의 부족 로딩으로 인해 약한 형광 신호가 발생합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 세포 조직 바운드 염료를 제거하는 100μM ADVASEP - 7을 사용합니다. 이 단계는 필요하지 않습니다,하지만 생략하면 ACSF의 워시 아웃 시간 연장해야합니다. 요약, 당신이 선택한 준비에 따라 최적의 레이블을 결정하기 위해 집중 로딩 기간을 수정해야합니다.
Acknowledgments
D. 세임스는 G. 해롤드 & 라일라 Y. 자선 재단과 과학의 컬럼비아 대학의 이니셔티브를 매더 감사드립니다.
D. 세임스 및 D. Sulzer는 신경 과학 수상의 맥나이트 기술 혁신에 대한 맥나이트 재단 감사
D. Sulzer이니다, NIMH, 그리고 Picower과 파킨슨병의 기초를 주셔서 감사합니다.
H. 장 감사는 NARSAD.
RH 에드워즈는 마이클 J. 폭스 재단, 국립 파킨슨병 재단니다 그리고 NIMH 감사합니다.
우리는 TIRF 현미경 설치와 기술 지원 6 OHDA 주사와 조언, 유용한 토론, 영상 분석 프로그램에 대한 Merek 시우에 대한 표시 Sonders 및 월 Schmoranzer에 대한 로버트 버크 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Columbia University - Dalibor Sames Lab | ||
| ADVASEP-7 | CyDex | AR-OA7-005 | |
| RC-27L Recording chamber | Warner Instruments | 64-0375 | |
| PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation |
| Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI |
References
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
- Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
- Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).
