Ett nytt sätt att mäta neurotransmission optiskt med fluorescerande dopamin-analoger.
Nervsystemet sänder signaler mellan nervceller via frisättningen av neurotransmittorer under synaptiska vesikler fusion. För att observera neurotransmittor upptag och utsläpp från enskilda presynaptiska terminalerna direkt utformade vi fluorescerande falska signalsubstanser som substrat för det synaptiska vesikler MAO transportör. Med hjälp av dessa sonder till bild dopaminfrisättning i striatum, gjorde vi flera observationer relevanta för synaptisk plasticitet. Vi fann att den del av synaptiska vesikler frigöra signalsubstansen per stimulans var beroende av stimulans frekvens. En kinetiskt distinkt "reserv" synaptiska vesikler befolkningen har inte observerats under dessa experimentella förhållanden. En frekvens-beroende heterogenitet presynaptiska terminaler avslöjades att var beroende dels på D2 dopaminreceptorer, vilket indikerar en mekanism för frekvensberoende kodning av presynaptiska urval.
Hui Zhang och Niko G. Gubernator bidragit lika för detta arbete.
I denna video visar vi en metod för att visualisera neurotransmission optiskt med fluorescerande dopamin-analoger. FFN511 är den första generationen av FFNS vi har utvecklat. Även om det var designad av inriktning på neuronala vesikulär MAO transportör (VMAT2) som bär monoaminoneurotransmittorer från cytoplasman in i synaptiska vesikler, och särskilt etiketter dopamin terminaler i striatum och förmodade katekolamin och / eller terminaler serotonin i cortex (som visas i Science papper), är en lämplig lastning tid avgörande för specificiteten eftersom FFN511 är relativt hydrofoba. Vi fann att inkubationstiden längre än 40 minuter kommer att resultera i omfattande icke-specifik färgning i striatum skivor. Specificiteten kan bli lätt bestämmas genom avfärgning med en hög koncentration av KCl, som bör orsaka utsläpp av FFN inom funktionella synaptiska blåsor. Exponering av slice till FFN511 för mindre än 15 minuter kommer att resultera i en svag fluorescerande signal på grund av otillräcklig lastning av färgen i terminalerna. I detta protokoll använder vi 100μM ADVASEP-7 för att ta bort färgen bunden till extracellulär vävnad. Detta steg är inte nödvändigt, men om det utelämnas, måste wash-out tid i ACSF förlängas. Sammanfattningsvis, beroende på förberedelserna du väljer, måste du ändra koncentrationen och lastning tid för att bestämma optimal märkning.
The authors have nothing to disclose.
D. Sames tackar G. Harold & Leila Y. Mathers Charitable Foundation och Columbia University initiativ inom vetenskap och teknik.
D. Sames och D. Sulzer tacka McKnight fonden för McKnight tekniska innovationer i neurovetenskap Award
D. Sulzer tack Nida, NiMH och Picower och Parkinsons stiftelser sjukdom.
H. Zhang tack NARSAD.
RH Edwards tackar Michael J. Fox Foundation, National Parkinsons Foundation, Nida och NiMH.
Vi tackar Robert Burke för 6-OHDA injektioner och råd, Mark Sonders för användbara diskussion, Merek Siu för bildanalys programmering, och Jan Schmoranzer för teknisk support med TIRF mikroskopi setup.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Dalibor Sames’s laboratory at Columbia University | |||
ADVASEP-7 | CyDex, Overland Park, KS | AR-OA7-005 | ||
RC-27L Recording chamber | Warner Instrument | 64-0375 | ||
PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation | |
Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI, Jerusalem, Israel |