인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Summary

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수 있습니다

Abstract

RNA 결합 단백질과 공동 immunoprecipitate (CO - IP)는 해당 바인딩 위치를 입증하여 splicing 우리의 이해를 증가했음을 RNAS를 배열하는 것은 종종 splicing 요소의 기능에 영향을 미칩니다. 그러나, 같은 샘플링 전략 splicing 요소에 바인딩된 RNA를 식별의 기회는 셀룰러 풍요에 비례합니다. 우리는 사전 mRNA 달리 과도에 대한 결합 특이성을 조사에 대한 체외 방식의 소설을 개발했습니다. 이 방법은 특별히 설계된 oligonucleotide 풀을 활용되는 introns, exons, 스플 라이스 분기점 또는 사전 mRNA 기타 전체 타일. 수영장은 분자 선택 어떤 종류의를 받게됩니다. 여기, 우리는 바운드와 언바운드 분수에 oligonucleotide를 분리하여 방법을 설명하고 바운드 분수의 각 oligonucleotide의 강화를 기록 두 색상 배열 전략을 사용합니다. 배열 데이터는 순서 특정 및 구조 사전 mRNA에 대한 구속력을 ribonucleoprotein (RNP)의 determinates 식별하는 능력을 가지고 고해상도지도를 생성합니다. 수영장이 특별히 사전 mRNA 순서에서 설계하고 합성이므로이 방법으로 독특한 장점은, 현재 IP와 S​​ELEX 기법과 관련된 mRNA 대한 샘플링 바이어스를 방지하는 기능입니다. 실험자들이 그들의 개인적인 필요에 수영장을 조정, 전체 연구 기와하는 지역을 선택 이후 oligonucleotide 수영장의 유연성은 또 다른 장점이라고 생각합니다. 이 기법을 사용, 하나는 분석 대규모 구속 또는 기능 splicing 기자로 라이브러리를 복제하고 포함 분수에 농축되는 oligonucleotides를 식별에 polymorphisms이나 돌연변이의 효과를하실 수 있습니다. 체외 고해상도 매핑 스키마에서이 소설은 낮은 풍부한 생체내 기술의 현재와 공부하기 어렵 만드는 과도 사전 mRNA 종과 RNP 상호 작용을 연구하는 독특한 방법을 제공합니다.

Protocol

풀 디자인과 oligo 복구

1. 첫 번째 단계는 공부하는 사전 mRNA 수영장을 설계하는 것입니다. 이것은 UCSC 게놈 브라우저를 사용하고 특정 유전자, 스플 라이스 분기점, 또는 관심있는 다른 분야를 다운로드 할 수 있습니다.
2. 관심 창문이 선택되고 나면, 그들에 걸쳐 타일이 계산은 다음 조건을 사용하여 읽을 수 길이는 따라서 각 oligo가 이전부터 20 세포핵을 이동하는 10 염기 오버랩, 30 세포핵해야합니다. * Oligo의 중복은 적절한 범위를 보장하기 위해 스플 라이스 사이트에 가까이 증가한다; 10-20 세포핵에서 중복을 증가하면이 작업을 수행할 수 있습니다.
3. 수영장의 하류를 증폭하는 데 사용됩니다 보편적인 뇌관 시퀀스, 각 30 염기 oligo 측면. 기와 oligo 주문은 시퀀스가​​ 지정 oligonucleotide microarray의 인쇄됩니다 애질런트에 제출하여야한다.
4. microarray 표면에서 DNA를 oligos를 복구하기 위해서는 슬라이드에 배열 하이브 리다이 제이션 챔버의 배열 커버 슬라이드를 삽입하고 부드럽게 DH ₂ O 500 μL를 pipetting으로 시작
5. 표지 슬라이드 위에 샌드위치 배열, 프로세스를 중단 할 수 공기 방울을 피하기 위해주의한다. oligos과 측면이 수면에 닿으 있도록 배열 얼굴을 아래로 배치해야합니다. 엄지의 좋은 규칙은 배열에있는 애질런트의 라벨 커버 슬라이드 애질런트 레이블을 직면하는 "애질런트 감동 애질런트"이라는 의미입니다
6. 하이브리드화 챔버를 닫고 하이브 리다이 제이션 오븐에 99 ° C에서 하룻밤 회전
7. 다음날, 조심스럽게 챔버에서 배열을 제거하고 이제 oligos는 배열 표면에서 해방이 들어있는 물을, 빼다. 이것은 oligo 풀 수 있습니다
8. 3~5초 펄스에 대한 1.5 ML Eppendorf 튜브에있는 수영장을 놓고 50 %의 진폭에 수영장 sonicate
9. 다음, 끝에 추가 T7 태그와 보편 primers를 사용하여 낮은 사이클 PCR에 의해 증폭 수영장. 에 대한 94에서 첫 라운드, 변성 ° C는 1 분, 20 초 동안 55 ° C에서 어닐링, 72시 1 분 길어지다 ° C. 후속 라운드 들어, 10 초, 20 초 10 초 72로 5 분 최종 신장 단계 ° C.으로 각 각 온도에서 할 수영장을 증폭하는 데 필요한 사이클의 수를는 oligo 복구의 효율성에 달려 있기 때문에, 여러 사이클 번호를 시도해야 할 수 있습니다. 아크릴 아미드 젤에 발랐습 밴드에 의해 의미있는 수영장,여 - 증폭하지 않도록주의하십시오. PCR 증폭 샘플이 필요 ° C까지 4 저장할 수 있습니다.
10. oligo 준비의 마지막 단계는 앰비온에서 MEGAshortscript ™ 키트를 사용하여 RNA를 녹음하는 것입니다. * 다음과 같은 프로토콜은 앰비온에서 적응되었습니다
    1. 얼음 T7 효소 믹스를 유지하면서 상온에서 T7 10X 반응 완충액, 넷 ribonucleotide 솔루션 및 물을 녹여
    2. 상온에서 RNase 무료 microcentrifuge 관에서 반응 혼합물을 조립. 반응이 얼음에 혼합 경우 반응 버퍼의 구성 요소 촉진하기 위해 템플릿 DNA가 발생할 수 있습니다.
    3. 다음과 같은 순서로, 피펫 3 μL nuclease - 무료 물, 10X 반응 완충액 2 μL, 각각 75 MM NTP 솔루션 2 μL, 템플릿 DNA 5 μL (PCR 증폭 oligo 수영장)과 T7 효소 2 μL에 대한 20 μL의 최종 부피
    4. 튜브 다음 간단히 튜브의 하단에있는 혼합물를 수집하는 microfuge 반응을 섞어 부드럽게 플릭.
    5. ° C 2 시간 37 thermocycler에 반응을 품어. 배양 시간은 템플릿에 의존되며, 따라서 그것은 최대한의 수확량에 대한 최적의 배양 시간을 결정하는 시간 코스 실험을 사용해야 할 수도 있습니다
    6. 2 시간 후에, 추가 15 분 37 반응과 부화 터보 DNase 1 μL를 추가 ° C를하여 템플릿 DNA를 제거
    7. 반응을 종료하고 페놀 / 클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 RNA를 복구합니다.
       1. 20 μL 반응 볼륨, DH ₂ O의 115 μL와 반응 3 M의 아세트산 나트륨 15 μL를 추가합니다.
       2. 클로로포름의 산성 페놀 75 μL의 75 μL를 추가 철저 다음 섞는다. 실온에서 13,000 rpm으로 일분 후 microfuge, vortexing하여 솔루션을 섞는다. 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송하고 추출을 반복
       3. 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송하고 클로로포름 150 μL를 추가합니다. 소용돌이 이전으로 혼합하고 원심 분리기. 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송합니다.
    8. 수성 계층 100 % 차가운 에탄올의 두 볼륨을 추가하고 잘 혼합하여 RNA를 복구합니다. -20 15 분 최소 혼합물을 냉각 ° C 다음 4 원심 분리기 ° 펠렛 RNA 최대 속도로 15 분 C. 조심스럽게 뜨는을 제거하고 0.1x 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TE) 버퍼 105 μL의 펠렛을 resuspend ..
11. 그것은 T7 키트 반응에서 무료 세포핵의 모두 제거되므로 가장 정확한 결과를 얻으려면 RiboGreen를 사용하여 RNA를 계량하기가 어렵습니다.
    1. quantitation를 시작하려면 먼저 2300 μL + 50μL/sample 충분한 1X TE를 희석.
    2. 다음 RiboGreen합니다. 당신이 1000 필요합니다 μL + 50 μL / 샘플. 하이 레인지 샘플 (1 μg / ML 20 NG / ML)은 1X TE에서 RiboGreen 1:200를 섞어, 낮은 범위 샘플 (50 NG / ML 1 NG / ML)는 1X TE에서 RiboGreen 1:2000 믹스 ; 피펫 불투명 판의 각 우물에 RiboGreen 솔루션을 50 μL, A1으로 시작 아래로 이동하지 전체
    3. 이 하이 레인지 샘플 또는 100 NG / 낮은 범위의 샘플 μL에 대한 μg / ML하는 RNA 주식 솔루션을 희석
    4. 주식 솔루션을 사용하여 원래의 2 μg / ML 또는 100 NG / ML 재고 여섯 이후 1시 2분 dilutions하여 표준 곡선을 작성, PCR 스트립 관에 주식 피펫 240 μL합니다. 나머지 7 튜브에 피펫 1X TE 120 μL. 잘 RNA 재고 120 μL을 가지고, 튜브 2 섞는다. 튜브 2 120 μL를 가지고 튜브 3 섞는다. 튜브 7까지 반복합니다. 튜브 8 단 TE가되고 공란으로 표시됩니다. 불투명 판, A1으로 표준 곡선 솔루션의 피펫 50 μL : H2 (두 번 커브를 실행)
    5. 새로운 튜브에 oligo 수영장 5 μL와 TE 45 μL를 혼합하고 RiboGreen 50 μL를 포함하는 잘하는 50 μL를 추가합니다.
    6. 접시 리더를 사용하면 485 나노미터와 530 나노미터의 방출 파장의 여기 파장과 1 분 혼합 후 위로부터 형광 읽고 접시를 읽을 수있는 기계를 설정
    7. -20 ° C.에 저장해야합니다 복구된 RNA를 정할 생성된 표준 곡선을 사용

관심 RNP와 oligo 수영장의 공동 immunoprecipitation

1. 이전 공동 immunoprecipitation을 시작하기 위해 A와 Invitrogen에서 단백질 G의 Dynabeads 반응 당 50 μL의 최종 볼륨에 1:1 비율로 그들을 혼합하여 단백질을 준비합니다. 예를 들어, 두 반응에 대해 50 μL 각 비드를 각각 추가합니다.
2. 당신은 차가운 1X PBS의 동일한 볼륨 두 번 뜨는을 제거하고 구슬을 씻어 동안 자리에 비즈를 잡아 Novagen에서이 같은 자성 분리 스탠드를 사용하여
3. 두 번째 세척 후, 차가운 1X PBS의 동일한 볼륨에있는 구슬을 resuspend과 반응 당 항체 2 NG를 추가합니다. 이 금액은 항체에 따라 달라질 수 있습니다, 실험의 최적 조건을 찾을 필요가 있도록.
4. 4 항체 / 비드 혼합물은 밤새 품어 회전 플랫폼에서 ° C
5. 아침에 비 특정 바인딩을 차단 sonicated 효모 총 RNA의 반응 당 2 μg을 추가하고, 4 추가 30 분 회전 ° C.
6. 비즈를 잡아 자기 랙를 사용하면, 튜브에서 두번째로 세척에서 PBS를 떠나, 차가운 1X PBS로 두 번 뜨는을 제거하고 구슬을 씻으십시오.
7. 새로운 튜브, 각 튜브에 각각의 반응과 비드 혼합물의 나누어지는 50 μL에 대해 하나를 가져가라. 마스터 믹스를 준비하는 동안 비즈 앉아서
8. 각각의 반응은 120 볼륨을 가져 200 oligo 수영장의 NG, 보호 primers의 몰 비율 sonicated 효모 총 RNA 2 μg, 헬라 핵 추출물 (이것은 RNP 소스입니다) 20 μL, 그리고 버퍼 E를 추가에 대한 μL. 보호 primers는 범용 primers의 RNA 버전입니다. 끝에 추가 T7 태그와 유니버셜 primers의 주문 전사 템플릿은 다음 MEGAshortscript ™ 키트를 사용하여 템플릿에서 RNA를 고쳐 쓰다.
9. 마스터 믹스 120 μL의 비드 aliquots과 resuspend 구슬의 표면에 뜨는를 제거합니다. 4 ° C 1~2시간에 대한 반응을 바위.
10. 부화 후, 각 반응에 대해, "총"RNA 샘플을위한 작은 나누어지는을 (비즈 포함) 삭제
11. 자성 분리 독립에 대한 반응의 나머지를 삽입하고 표면에 뜨는를 제거합니다. 이 샘플을 통해 하류 흐름이 분석하는 데 필요한 것은 아니지만, 그것은 저장하는 것이 유용할 수 있습니다.
12. 차가운 1X PBS 50 μL와 비즈 1-2 번 씻으십시오. 비즈에 대한 항체에 바인딩된 RNA는 "IP"예제입니다.
13. 0.1x TE 버퍼에 1% SDS 50 μL의 "총"과 "IP"구슬을 Resuspend하고 ° C 15 분 동안 RNA를 elute 65에서 샘플을 가열.
14. 이제 이전에 비즈로 바운드되어 에탄올 침전 다음 페놀 / 클로로포름 추출에 의해 깨끗한 RNA를 포함하는 표면에 뜨는를 제거합니다. 펠렛 건조 50 μL 0.1x TE 버퍼에 resuspend.

aminoallyl 라벨에 대비하여 역방향 전사와 공동 IP 샘플의 증폭

1. 다음, RNA 샘플은 역방향 베꼈는데과 PCR은 증폭해야합니다. 반대 전사 반응은 반대로 보편 primers를 사용합니다.
2. 각 샘플의 경우, 1 μL를 혼합하여 시작반대 범용 템플릿 RNA 1 μL와 뇌관 (immunoprecipitation 반응에서)와 DH ₂ O를 10 μL ° 5 분 C는 다음 얼음에 진정 또는 4에서 보관 ° C. 70 반응 히트
3. 샘플 냉각하는 동안 다음과 같은 마스터 믹스를 확인하십시오. 각각의 반응을위한 10 MM dNTPs 4 μL, 10X Arrayscript 버퍼 ​​2 μL, 1 μL RNase 억제제, 1 μL 역방향 전사 효소를 결합. 철저하게 혼합하고 각 역방향 전사 반응에 마스터 믹스 8 μL를 추가합니다.
4. 95 다음 2 시간 동안 42 ° C에서 샘플을 부화 ° 후 5 분 C, 4 ° C 샘플을 증폭에 필요한 때까지. PCR 기계를 사용
5. 반대로 RNA 샘플을 해독 후, PCR은 T7 태그가 포함된 primers 중 하나의 보편 primers를 사용하여 증폭. 그것이 여러 사이클을 시도해야 할 수 있도록 수영장을 증폭하는 데 필요한 사이클의 개수는 공동 IP의 효율성에 따라 달라집니다. 각 반응은 10X DNA 형성 촉매 반응 버퍼, 각각의 프라이머 (100 ㎜), cDNA 템플릿 1 μL (역 전사 반응에서), 10 MM dNTPs 1 μL, DH ₂ O의 42.2 μL의 0.2 μL 5 μL 있어야하고, DNA 형성 촉매 효소 0.4 μL.
   
   3 분 94 ° C에서 샘플을 잠복기로 PCR을 시작합니다. 다음, 94 각 사이클, 변성에 대한 ° 45 초 동안 C는 30 초 동안 55 ° C를 어닐링, 10 분 72 ° C에서 최종 연신율과 일분 72 ° C에서 연장하다.
6. 다음 MEGAshortscript ™ 키트를 사용하여 다시 샘플을 고쳐 쓰다, 그러나이 시간은 aminoallyl UTP 2 μL를 추가, 대신 T7 UTP니다. aminoallyl UTP는 싸이의 염료와 RNA 레이블을하는 데 사용됩니다.
7. 페놀 / 클로로포름과 에탄올의 샘플을 촉진. Glycoblue 또는 암모늄 아세테이트를 사용하지 마십시오, 둘 중 배열에 샘플의 하이브리드화를 방해할 수 있습니다. 0.1 M 나트륨 탄산염 4.5 μL의 펠렛 및 resuspend 건조.

싸이의 염료와 RNA의 아미노 알릴 라벨링

1. 라벨 프로토콜은 DMSO 45 μL에서, 형광 염료, cy3 및 cy5 각 디졸브 시작합니다. 빛을 피하려면, 어둠 속에 -20 ° C에서 알루미늄 호일과 저장소에있는 튜브를 랩
2. RNA 샘플을 철저히 섞어 nuclease없는 물 2.5 μL 추가
3. 다음, "IP"샘플에있는 "전체"샘플로 Cy3 3 μL와 Cy5 3 μL를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 샘플을 품어, 싸이 - 5은 파란색으로 바뀔 것이다 반면 싸이 - 3 샘플은 빨간색 또는 분홍색으로 바뀔 것이다.
4. 반응을 종료하기 위해, 각 샘플 4 M - 히드록 실 아민 HCL 6 UL을 추가 철저하게 혼합하고 짧게 스핀. 실온에서 15 분 동안 품어.
5. 0.1x TE 50 μL의 에탄올 강수량과 resuspend 펠렛 다음 페놀 / 클로로포름 추출에 의해 표시된 샘플을 정화

애질런트의 배열 하이브 리다이 제이션 키트를 사용하여 microarray에 샘플을 잡종

1. 부드럽게 10X 차단 버퍼의 μL nuclease 무료 H2 _O, Cy3 - 라벨 "총"수영장, Cy5 - 라벨 "IP"수영장의 25 μL의 25 μL, 10 140 μL의 50 μL를 혼합하여 하이브 리다이 제이션을 시작 25x 조각 버퍼와 2X 하이브리드화 버퍼 250 μL은 거품을 소개 않도록주의한다. 간단히 튜브의 바닥에있는 솔루션을 수집하고 또한 거품을 줄이기 위해 샘플을 Microfuge.
2. 하이브 리다이 제이션 챔버에 O - 링 커버 슬라이드를 삽입하고 조심스럽게 슬라이드에 솔루션을 피펫.
3. "샌드위치"솔루션을 위해 커버 슬라이드 위에 감지 배열을 놓습니다. 배열에있는 애질런트의 라벨 커버 슬라이드 애질런트 레이블을 직면 수 있도록 방향 배열 슬라이드 것을 잊지 마십시오.
4. 하이브 리다이 제이션 챔버에서 슬라이드 / 배열 샌드위치를​​ 고정하고 3 시간 동안 50 ° C에서 회전.
5. 배열 회전하는 동안, 50 - ML 원뿔 튜브에 다음과 같은 50 ML 솔루션을 하나 원뿔 DH ₂ O, 별도의 튜브에 두 1X SCC 버퍼 솔루션, 각 한 2X SCC 버퍼 50 ML 가득.
6. 3 시간 배양 후, 신중하게 배열 / 슬라이드 샌드위치를​​ unclamp하고 2X SCC 버퍼를 포함하는 50 ML 원뿔에 놓으십시오. 족집게 한 켤레를 사용하여 부드럽게 커버 슬라이드에서 배열을 분리하여 커버 슬라이드를 빼낸다. 슬라이드가 꺼내와 같이 배열을 만지지 않도록주의하십시오. 원뿔을 닫고 부드럽게 60 초 동안 반전.
7. 족집게를 사용하여 1X SCC 솔루션에 배열을 전송, 튜브를 마개, 그리고 조심스럽게 1X SCC 솔루션에 배열을 전달하고 다시 부드럽게 다른 분에 대한 반전 후 1 분 반전.
8. 마지막으로, DH ₂ O의 튜브에 배열을 전달하고 부드럽게 30 초 동안 반전.
9. Kimwipe에있는 슬라이드의 가장자리를 배치하여 배열을 건조. 의 배열을 회전 계속 oligos를 포함하는 측면을 방해하지 않도록해야 할 닦으십시오.
10. 에서 건조 배열을 플레이스Microarray 스캐너와 빈 50 ML 원뿔 튜브 및 검사

Microarray를 해석

1. microarray 스캐너는 배열의 TIF 이미지를 생성합니다. 특정 수영장에 고유한 그리드 파일 (애질런트가 제공하는)를 사용하여 애질런트 기능 추출 소프트웨어를 통해이 이미지를 실행합니다.
2. 애질런트 소프트웨어는 펄 스크립트 구문 분석 파일을 만들고, 각 기능에서 신호를 해석합니다. 각 기능에서 신호가 해당 채널의 총 농도로 정상화됩니다. 녹색 채널에 특정 기능에 예를 들어, 각각의 기능에 대한 녹색 채널의 강도는 모든 기능을 통해 녹색 채널의 총 농도로 나눈 값입니다. 최종 출력은 배열에있는 각 기능의 녹색 채널을 통해 적색 채널의 로그 비율이다.
3. microarray에서 oligo 풀 데이터의 사진을 얻을 수있는 게놈으로 다시 매핑하고, 어떻게 강하게, 관심 RNP는 바운드 수 있습니다.

그림 1. 실험 개략도

A.이 계획을 기와. 선택한 관심 사전 mRNA 시퀀스를 다운로드 후, 선택 영역은 그 10 뉴클레오 티드 단위로 교대 30 뉴클레오 티드 창문을 통해 타일​​입니다. 윈도우 유니버셜 프라이머 결합 사이트 플랭크 각 측면.

B. 합성 배열입니다. 기와 oligo 주문은 시퀀스가​​ 지정 oligonucleotide microarray의 인쇄됩니다 애질런트에 제출하여야한다.

C. 공동 immunoprecipitation. 배열에서 oligos를 끓는 후, 헬라 핵 추출물에서 부화 후 관심 RNP에 대한 항체와 준비가되어 자기 구슬로 추출을 추가합니다. Cy3와 함께 시작 oligo 수영장과 Cy5와 바운드 IP 수영장을 분류하고 감지 배열 및 스캔에 적용됩니다.

그림 2. 와 게놈 및 농축 데이터의 분석을 주석.

A.는 평균 기지 - 텐 로그 배열 데이터에서 각 게놈 조정에 점수와지도를 변환하는 주어진 좌표로 점수. 이 평균 단계의 그림 3은 각 10 NT 윈도우의 평균 농축 점수가 위의 그래프는 2 득점, 4 및 0.5, 30 - NT의 oligos를 중복을 위해 제공됩니다. 선택한 게놈 영역은 USCS의 게놈 브라우저에서 사용자 지정 추적을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 주어진 예제 브라우저 창이 유전자 기능 (exons / introns / 대체 splicing 등) 진한 빨간색 세로 막대로 표시됩니다 PTB - 바운드 oligos에서 아래와 로그 평균 농축 성적 따라 부여됩니다 clta 유전자에있다. PTB 적극 polypyrimidine 트랙트에 불과 상류 엑슨 2 바인딩합니다.

Discussion

수영장의 생성을 기억하는이 절차는 중요 할 때하면 RNA 또는 단백질 수준 중 하나에서 유연하고 수정하기 위해 열려 있습니다. RNA 수준에서 orthologous 지역 질병 돌연변이, polymorphisms, 또는 무작위 돌연변이 oligonucleotide 순서에 소개하실 수 있습니다. 단백질 수준에서 RNA 바인딩 요소는 인산화 또는 다른 게시 translational 수정하여 수정할 수 있습니다. 또한 바인딩 환경 중 상호 작용이나 관심의 RNA 결합 단백질과 경쟁할 추가 요인의 수준을 증가 또는 감소로 조작할 수 있습니다.