İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Summary

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor olabilir

Abstract

RNA'lar Sıralama RNA bağlayıcı proteinler ile birlikte immunoprecipitate (co-IP), bu bağlayıcı konuma göstererek ekleme anlayışımız artan sıklıkla bir ekleme faktörü fonksiyonu etkiler. Ancak, herhangi bir örnekleme stratejisi ile bir ekleme faktörüne bağlı bir RNA belirleme şansı hücresel bolluk orantılıdır. Biz aksi takdirde geçici pre-mRNA bağlayıcı özgüllüğü araştırmak için bir roman in vitro yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, özel olarak tasarlanmış bir oligonükleotid havuzu kullanan intronlar, ekzon, ek kavşaklar, veya diğer pre-mRNA boyunca fayans. Havuz, bir tür moleküler seçim tabi tutulur. Burada, ilişkili ve ilişkisiz bir bölümünü içine oligonükleotid ayırarak yöntem göstermek ve bağlı fraksiyon her oligonükleotid zenginleştirme kaydetmek için bir iki renk dizisi stratejisi kullanacaklardır. Dizi veri dizisi özel ve yapısal pre-mRNA bağlayıcı ribonükleoprotein (RNP) determinates tanımlamak için yeteneği ile yüksek çözünürlüklü haritalar üretir. Bu yöntem için eşsiz bir avantajı havuz özellikle pre-mRNA dizisi tasarlanmış ve sentezlenmiş olarak, mevcut IP ve SELEX teknikleri ile ilgili mRNA doğru örnekleme yanlılığı önlemek için yeteneğidir. Deneyci, havuzu kendi ihtiyaçlarına uyarlayarak çapında çalışma ve kiremit hangi bölgeleri seçer oligonükleotid havuzu esneklik başka bir avantajdır. Bu tekniği kullanarak, bir tahlil büyük bir ölçekte bağlayıcı veya fonksiyonel bir ekleme muhabiri kütüphane klon ve fraksiyonunda zenginleştirilmiş olduğunu oligonükleotidler tespit polimorfizmleri veya mutasyonların etkileri. In vitro yüksek çözünürlüklü eşleştirme düzenini Bu roman düşük bolluk in vivo teknikler mevcut çalışma zorlaştırır geçici pre-mRNA türleri, RNP etkileşimleri çalışmak için benzersiz bir şekilde sağlar.

Protocol

Havuz tasarımı ve oligo kurtarma

1. Incelenmesi gereken ilk adım, pre-mRNA havuzu tasarımı. Bu UCSC Genom Tarayıcı kullanarak ve belirli genler, ek kavşaklar, ya da diğer ilgi alanları indirme yapılabilir.
2. Ilgi pencereler seçildikten sonra, onlar karşısında kiremit hesaplama aşağıdaki koşullar kullanılarak okuma süresini, bu nedenle her oligo önceki 20 nükleotidler kaydırılır bir 10 nükleotid örtüşme, 30 nükleotid olmalıdır. * Oligo örtüşme yeterli kapsama sağlamak için ek sitelerine yakınlığı artan olmalıdır; 10 20 nükleotidler örtüşme artırarak bunu başarabilirsiniz.
3. Havuz downstream yükseltmek için kullanılan olacak evrensel astar dizileri, her biri 30 nükleotid oligo Kanat. Agilent, dizileri, özel bir oligonükleotid mikroarray basılacaktır Çinili oligo siparişleri teslim edilmelidir.
4. Mikroarray yüzeyinden DNA oligos kurtarmak için bir dizi hibridizasyon odasında dizi kapak slayt slayt üzerine yerleştirerek ve hafifçe 500 mcL dH ₂ O pipetleme başlamak
5. Sandwich kapağını kaydırarak üstüne dizi, süreci bozabilir hava kabarcıklarını önlemek için özen. Oligos ile yan su yüzeyine dokunarak böylece dizi yüz aşağı yere emin olun. Başparmak bir kural dizisi üzerinde Agilent etiket kapak slayt Agilent etiketi karşı karşıya olduğu "Agilent dokunur Agilent" anlamına
6. Hibridizasyon odasına kapatın ve bir melezleşme fırında 99 ° C'de gece boyunca döndürmek.
7. Ertesi gün, dikkatle odasından dizi kaldırmak ve oligos dizi yüzey kurtuldu içeren su, çekmek. Bu oligo havuzu
8. Havuz için 1.5 ml Eppendorf tüp 3-5 ikinci bakliyat yerleştirin ve% 50 genlik havuzu sonikasyon
9. Sonra, sonuna T7 etiketiyle evrensel primerler kullanılarak, düşük devir PCR ile havuz yükseltmek. Için ilk turda 94, doğasını ° C 1 dakika 20 saniye boyunca 55 ° C'de tavlama ve 72 az 1 dakika için uzatıyoruz ° C. Bir sonraki tur için, 10 saniye, 20 saniye ve 10 saniye 72 az 5 dakika nihai bir uzama adım ° C ile ilgili her sıcaklıkta Havuz yükseltmek için gerekli döngülerinin sayısını oligo kurtarma etkinliğini bağlı olduğundan, birden fazla döngüsü numaraları denemek için gerekli olabilir. Bulaşmış bir akrilamid jel üzerinde bir grup tarafından anlamına havuzu, aşırı yükseltmek için dikkatli olun. PCR amplifiye örnekleri gerekli ° C ye kadar 4 saklanabilir.
10. Oligo hazırlanmasında son adım Ambion MEGAshortscript ™ kiti kullanılarak RNA yazıya. * Aşağıdaki protokol Ambion adapte edilmiştir
    1. Oda sıcaklığında T7 10x Reaksiyon Tamponu, dört ribonukleotid çözümler su ve buz üzerinde T7 Enzim Mix tutarken çözülme
    2. Reaksiyon karışımı oda sıcaklığında bir RNaz ücretsiz mikrosantrifüj tüp birleştirin. Reaksiyon tamponu Bileşenleri tepki buz üzerinde işlendiği takdirde DNA çökelmesine neden olabilir.
    3. Aşağıdaki sırayla, pipet 3 mcL nükleaz içermeyen su, 10x reaksiyon tamponu 2 mcL, her 75 mM NTP çözüm 2 mcL, 5 mcL (PCR amplifiye oligo havuzu) DNA ve 2 T7 enzim mcL 20 mcL son hacim
    4. Tüp, ardından kısa bir süre tüpün alt karışımı toplamak için mikrofuge'de reaksiyon karışımı hafifçe vurun.
    5. Bir PCR reaksiyonu 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon süresi şablon bağımlı olacaktır, bu nedenle, maksimum verim için en uygun inkübasyon süresi belirlemek için bir süre ders deney kullanmak için gerekli olabilir
    6. 2 saat sonra, ek bir 15 dakika için 37 reaksiyon ve inkübe Turbo DNaz 1 mcL ekleyerek ° C DNA kaldırmak
    7. Reaksiyon feshedebilir ve RNA, fenol / kloroform ekstraksiyon ve etanol yağış kurtarmak.
       1. 20 mcL reaksiyon hacmi için 115 dH ₂ O mcL ve reaksiyon 3 M sodyum asetat 15 mcL ekleyin.
       2. Asidik fenol ve kloroform 75 mcL 75 mcL ekleyin sonra iyice karıştırın. 13.000 rpm hızında oda sıcaklığında bir dakika sonra mikrofuge'de, vorteks çözüm karıştırın. Yeni bir tüp sulu tabaka transferi ve çıkarma tekrarlayın
       3. Yeni bir tüp sulu tabaka transferi ve kloroform 150 mcL ekleyin. Vorteks, daha önce olduğu gibi karışım ve santrifüj. Yeni bir tüp sulu aktarın.
    8. % 100 soğuk etanol iki cilt sulu katman ekleme ve iyi karıştırma RNA kurtarın. -20, 15 dakika en az karışımı soğutun ° C daha sonra 4 santrifüj ° C maksimum hızda 15 dakika boyunca pelet RNA. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 0.1x Tris-EDTA (TE) Tampon 105 mcL pelet tekrar süspansiyon haline getirin ..
11. Bu, tüm serbest nükleotidler T7 Kit tepki kaldırmak için en doğru sonuçları, RiboGreen kullanarak RNA miktarını zordur.
    1. Kantitatif başlamak için, ilk 2.300 mcL + 50μL/sample yeterli 1x TE sulandırmak.
    2. Sonra, RiboGreen olun. 1000 gerekecektir mcL + 50 mcL / örnek. Yüksek oranda örnekleri (1 mcg / ml ile 20 ng / ml), 1x TE RiboGreen 1:200 karışımı, düşük aralık örnekleri için (50 ng / ml 'ye 1 ng / ml), 1x TE RiboGreen 1:2000 karışımı ; Pipet opak bir plaka her kuyuya RiboGreen çözüm 50 mcL, A1 ile başlayan ve aşağı hareket değil, karşısında
    3. 2 yüksek oranda numune veya 100 ng / mcL düşük aralık örnekleri için mikrogram / ml RNA stok çözeltinin
    4. Orijinal 2 mcg / ml veya 100 ng / ml stok altı sonraki 01:02 dilüsyonları stok çözümlerini kullanarak, standart bir eğri oluşturmak; PCR şerit tüpe stokunun Pipet 240 mcL. Kalan 7 tüpleri, pipet 1x TE 120 mcL. RNA stok 120 mcL alın ve tüp 2 ile karıştırın. Tüp 2 120 mcL alın ve tüp 3 ile karıştırın. Tüp 7 kadar tekrarlayın. Tube 8 sadece TE olacak ve boş olacaktır. Opak levha, A1, standart eğri çözümler Pipet 50 mcL: H2 (eğri iki kez çalıştırmak)
    5. Yeni bir tüp, oligo havuzu 5 mcL TE 45 mcL karıştırın ve 50 mcL RiboGreen, içerir iyi 50 mcL ekleyin.
    6. Bir plaka okuyucu kullanarak bir dalgaboyu 485 nm ve 530 nm emisyon dalga boyu ile bir dakika karıştırın, sonra üst floresan okumak ve plaka okuma için makineyi
    7. -20 ° C'de muhafaza edilmelidir kurtarılan RNA ölçmek için oluşturulan standart eğrisi, kullanın

Bir ilgi RNP oligo havuzu Co-immunoprecipitation

1. Co-immunoprecipitation başlamadan önce protein, A ve G Dynabeads Invitrogen gelen protein reaksiyon başına 50 mcL son hacmi 1:1 oranında karıştırılarak hazırlar. Örneğin, iki reaksiyon için 50 mcL her boncuk her eklersiniz.
2. Süpernatantı eşit hacimli soğuk 1x PBS ile iki kez kaldırmak ve boncuklar yıkayın boncuk yerde tutmak için Novagen bu gibi bir Manyetik Ayırma Stand kullanın
3. İkinci yıkamadan sonra, soğuk 1x PBS eşit hacimde boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin ve 2 ng başına antikor reaksiyonu ekleyin. Bu miktar antikor bağlı olarak değişebilir, deneme optimal koşullarda bulmak için gerekli.
4. 4 antikor / boncuk karışımı bir gecede inkübe dönen bir platform üzerinde ° C
5. Sabah, non-spesifik bağlama engellemek için sonicated maya toplam RNA reaksiyon başına 2 mg ve 4 ek bir 30 dakika çevirin ° C
6. Boncuk tutmak için manyetik raf kullanarak, tüp içinde ikinci yıkama PBS bırakarak, soğuk 1x PBS ile iki kez süpernatant kaldırmak ve boncuk yıkayın.
7. Yeni tüpler, her bir tüpe her reaksiyon ve boncuk karışımı kısım 50 mcL çıkartın. Bir ana karışımı hazırlarken boncuk oturup
8. Her reaksiyon hacmi 120 getirmek için 200 ng oligo havuzu, koruma primerlerin ekimolar oranı, 2 mg sonicated maya toplam RNA, 20 mcL HeLa nükleer ekstresi (bu RNP kaynak) ve tampon E eklemek mcL. Koruma astarlar evrensel primerler RNA sürümleri. Sipariş transkripsiyon sonuna T7 etiketiyle evrensel primerler şablonları, daha sonra MEGAshortscript ™ Kit kullanarak şablonlar RNA yazıya.
9. Ana karışımı 120 mcL ve tekrar süspansiyon boncuk boncuk alikotları süpernatantı. 4 ° C'de 1-2 saat süreyle Rock reaksiyonlar.
10. Inkübasyondan sonra, her bir reaksiyon için, bir "toplam" RNA örnek için küçük bir kısım (boncuklar dahil) kaldırmak
11. Manyetik ayırma stand reaksiyonlar kalan koyun ve süpernatantı kaldırmak. Örnek downstream üzerinden akış, bu analiz için gerekli olmamasına rağmen, bunu kaydetmek için yararlı olabilir.
12. Soğuk 1x PBS 50 mcL boncuklar 1-2 kez yıkayın. Boncuk üzerinde antikor bağlı RNA "IP" örnek.
13. 0.1x TE tampon% 1 SDS 50 mcL "toplam" ve "IP" boncuk süspanse edin ve 65 ° C'de 15 dakika süreyle RNA Zehir örnekleri ısı.
14. Şimdi daha önce boncuk bağlı ve fenol / kloroform ekstraksiyon etanol yağış takip, temiz RNA içerir süpernatantı çıkarın. Kuru pelet ve 50 mcL 0.1x TE tampon tekrar süspansiyon haline getirin.

Ters transkripsiyon ve co-IP örnekleri amplifikasyon aminoallyl etiketleme için hazırlık

1. Sonra, RNA örnekleri ters transkripsiyonu ve PCR amplifiye olmalıdır. Ters transkripsiyon reaksiyonu için, ters evrensel primerler kullanın.
2. Her örnek için, 1 mcL karıştırma başlar1 mcL şablonu RNA ters evrensel astar (immunoprecipitation tepki) ve dH ₂ O 10 mcL Reaksiyonlar 70 ° C 5 dakika buz üzerinde soğutun ya da 4 tutmak ° C'ye ısıtın.
3. Örnekleri serin olsa da, şu ana karışımı olun. Her reaksiyon için 10 mM dNTP 4 mcL, 2 mcL 10x Arrayscript tampon, 1 mcL RNaz inhibitörü, 1 mcL ters transkripsiyon enzim birleştirir. İyice karıştırın ve her ters transkripsiyon reaksiyonu ana karışımı 8 mcL ekleyin.
4. 95 numuneler 42 ° C'de 2 saat süreyle inkübe ° C, daha sonra 5 dakika boyunca 4 ° C örnekleri amplifikasyon için gerekli olan kadar. PCR makinesi kullanın.
5. RNA örnekleri ters transkripsiyon sonra, PCR, bir T7 etiketi içeren primerler biri ile evrensel primerler kullanarak onları yükseltmek. Birden fazla döngüleri denemek için gerekli olabilir, böylece havuz yükseltmek için gerekli sayısı döngüleri ortak IP verimliliğine bağlı olacaktır. Her reaksiyon 10x Taq reaksiyon tamponu, her astar (100 mM), cDNA şablon 1 mcL (ters transkripsiyon reaksiyonu), 10 mM dNTP 1 mcL dH ₂ O 42.2 mcL 0.2 mcL 5 mcL gerektirir ve Taq enziminin 0.4 mcL.
   
   PCR örnekleri, 3 dakika boyunca 94 ° C'de inkübe başlayın. Sonra, her döngüsü, 94 doğasını ° C 45 saniye, 30 saniye boyunca ° C 55 tavlama ve 72 ° C'de 10 dakika için son bir uzama, bir dakika için 72 ° C'de uzatıyoruz.
6. Sonra, MEGAshortscript ™ Kit kullanarak tekrar örnekleri yazıya, ancak, bu kez 2 aminoallyl UTP mcL eklemek yerine, T7 UTP. Aminoallyl UTP Cy boyalar ile RNA etiketlemek için kullanılır.
7. Fenol / kloroform ve etanol örnekleri hızlandırabilir. Glycoblue veya amonyum asetat kullanmayın, her ikisi de dizi örnekleri melezleşmesi engel olabilir. 4.5, 0.1 M sodyum karbonat mcL pelet ve tekrar süspansiyon kurulayın.

Amino-Cy Boyalar RNA alil etiketleme

1. Etiketleme protokol DMSO 45 mcL, floresan boya, cy3 ve Cy5 her çözülür başlamak için. Işık önlemek için, karanlıkta, alüminyum folyo ve -20 ° C'de deposunda tüpler sarın
2. Örnekleri RNA 2.5 nükleaz içermeyen su mcL ekleyin ve iyice karıştırın
3. Sonra, "IP" örnek "toplam" örnek Cy3 3 mcL ve Cy5 3 mcL ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 1 saat süreyle karanlıkta inkübe, Cy-5 maviye dönecek iken Cy-3 örnek, kırmızı ya da pembe dönecek.
4. Reaksiyonu sonlandırmak için, her numune 6 uL 4 M hidroksilamin-HCl ekleyin, iyice karıştırın ve kısaca döndürün. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
5. 0.1x TE 50 mcL etanol yağış ve tekrar süspansiyon pelet takip fenol / kloroform ekstraksiyon etiketli örnekleri arındırın

Agilent Dizi Hibridizasyon Kiti kullanarak mikroarray örnekleri melezleşme

1. 10x engelleme tampon, 140 mcL mcL nükleaz içermeyen H2 _O Cy3 etiketli "toplam" havuz, Cy5 etiketli "IP" havuz 25 mcL 25 mcL, 10, 50 mcL yavaşça karıştırarak hibridizasyon başlayın 25x parçalanma tampon ve 2x hibridizasyon tamponu 250 mcL, kabarcıklar tanıtan önlemek için özen gösterin. Kısaca, tüp altında çözüm toplamak ve kabarcıkları azaltmak için de örnek mikrofuge'de.
2. Hibridizasyon odasında o-ring kapağını kaydırarak yerleştirin ve dikkatli bir slayt üzerine çözüm pipetle.
3. Algılama dizisi "sandviç" çözüm kapağını kaydırarak üstüne yerleştirin. Dizi Agilent etiket kapak slayt Agilent etiketi bakacak şekilde yönlendirmek dizi slayt unutmayın.
4. Kelepçe hibridizasyon odasında slayt / dizi sandviç ve 50 ° C'de 3 saat boyunca döndürün.
5. Dizi dönen iken, 50-ml konik tüpler aşağıdaki 50 ml çözüm: Bir konik dH ₂ O, ayrı bir tüp içinde iki 1x SCC tampon çözeltiler, her, bir 2x SCC tampon 50 ml ile dolu.
6. Üç saatlik inkübasyondan sonra, dikkatli bir dizi / slayt sandviç çözülme ve 2x SCC tampon içeren 50 ml konik yerleştirin. Bir cımbız kullanarak, yavaşça kapağını kaydırarak dizinin ayrı ve kapağını kaydırarak dışarı doğru çekin. Slayt çekilir gibi dizi temas için dikkatli olun. Konik kapatın ve 60 saniye boyunca yavaşça ters çevirin.
7. Cımbız kullanarak, 1x SCC çözümü için dizi transferi, tüp kap ve hafifçe dizinin ikinci 1x SCC çözüm transferi ve 1 dakika sonra tekrar yavaşça bir dakika için ters ters.
8. Son olarak, dH ₂ O tüp dizi transferi ve 30 saniye boyunca yavaşça ters çevirin.
9. Dizideki bir Kimwipe slayt kenarları koyarak kurulayın. Devam dizi döndürmek için oligos içeren yan bozmayacak emin olun silin.
10. Kuru dizi yerleştirin.Mikroarray tarayıcı ile boş bir 50 mL konik tüpü ve tarama

Mikroarray yorumlama

1. Mikroarray tarayıcı dizi TIF görüntü yaratacaktır. Agilent Feature Extraction yazılımı aracılığıyla bu görüntüyü kullanarak, özel havuzu benzersiz ızgara dosya (Agilent tarafından sağlanan) çalıştırın.
2. Agilent yazılımı bir Perl betiği ile ayrıştırılır bir dosya oluşturmak için her özellik sinyal yorumlayabilir. Her özellik sinyali o kanalda toplam yoğunluğu normale. Yeşil kanal belirli bir özelliği Örneğin, bireysel özellik için yeşil kanal yoğunluğu tüm özellikleri üzerinde yeşil kanal toplam yoğunluğu ile ayrılır. Nihai çıkış dizinin her özelliği yeşil kanal üzerinden kırmızı kanalın günlük oranıdır.
3. Mikroarray oligo havuzu veri bir resim elde etmek için genomuna yeniden eşlenir ve ne kadar güçlü, ilgi RNP bağlı olabilir.

Şekil 1. Deneysel şematik

A. şeması Fayansları. Seçme ve pre-mRNA dizileri faiz indirirken sonra, seçerek alan 10 nükleotid artışlarla vardiya 30 nükleotid pencereler ile döşenir. Evrensel astar bağlayıcı siteleri kanadını pencerenin her iki tarafında.

B. Sentez dizi. Agilent, dizileri, özel bir oligonükleotid mikroarray basılacaktır Çinili oligo siparişleri teslim edilmelidir.

C. Co immunoprecipitation. Dizi kapalı oligos kaynatıldıktan sonra, HeLa nükleer özü de inkübe, daha sonra ilgi RNP karşı bir antikor ile hazırlanmış manyetik boncuk özü ekleyin. Cy3 ile başlayan oligo havuzu ve Cy5 bağlı IP havuzu Etiket ve algılama dizi ve tarama için geçerlidir.

Şekil 2. Annotating genomu ve zenginleştirme veri analizi.

A. Convert ortalama dizi veri tabanı on günlüğüne skoru her genomik koordinat ve harita verilen koordinatları puan. Bu ortalama adım 3 ile ortalama zenginleştirme skoru 10-nt her pencere için yukarıdaki grafikler halinde puanları 2, 4 ve 0.5, 30-nt oligos örtüşen bir örnek verilir. Seçilen genomik bölgelerde Deneylerde Genom Tarayıcı Özel bir Track kullanılarak görüntülendi. Verilen örnekte bir tarayıcı penceresi clta gen, gen özellikleri (ekzon / intron / alternatif ekleme vb), koyu kırmızı dikey çubuklar tarafından temsil PTB bağlı oligos alt ve günlük ortalama zenginleştirme puanları boyunca verilmiştir. PTB güçlü polypyrimidine yolu sadece upstream ekzon 2 bağlar.

Discussion

RNA veya protein düzeyi ya havuz bu yaratılış hatırlamak için bu yordamı bu çok önemli yaparken esnek ve modifikasyon açık. RNA düzeyinde orthologous bölgelerde, hastalık mutasyonlar, polimorfizmleri, ya da rastgele mutasyonların oligonükleotid dizisi içine sokulabilir. RNA bağlayıcı faktör protein düzeyinde fosforilasyon veya diğer post translasyonel modifikasyonlar tarafından değiştirilebilir. Ayrıca, bağlayıcı bir ortamda ya ek faktörlerin etkileşim veya ilgi RNA bağlayıcı protein ile rekabet düzeylerini artırmak veya azaltmak için manipüle edilebilir.