Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Summary

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e estudar

Abstract

Seqüenciamento RNAs que co-immunoprecipitate (co-IP) com proteínas de ligação RNA tem aumentado nossa compreensão de splicing, demonstrando que a localização de ligação, muitas vezes influencia a função de um fator de splicing. No entanto, como em qualquer estratégia de amostragem a chance de identificar um RNA ligado a um fator de splicing é proporcional à sua abundância celular. Nós desenvolvemos um romance abordagem in vitro para o levantamento especificidade de ligação de outra forma transitória pré-mRNA. Esta abordagem utiliza uma piscina projetada especificamente oligonucleotídeo que as telhas em introns, exons, junções de emenda ou outros pré-mRNA. A piscina é submetido a algum tipo de seleção molecular. Aqui, nós demonstrar o método, separando o oligonucleotídeo em uma fração associados e não associados e utilizar uma estratégia de duas variedade de cores para gravar o enriquecimento de cada oligonucleotídeo na fração ligada. Os dados de matriz gera mapas de alta resolução com a capacidade de identificar sequências específicas e estruturais determinantes da ribonucleoproteína (RNP) obrigatórias para pré-mRNA. A única vantagem deste método é a sua capacidade para evitar o viés de amostragem para mRNA associado IP atual e técnicas SELEX, como a piscina foi especificamente projetado e sintetizado a partir do mRNA de pré-seqüência. A flexibilidade da piscina oligonucleotídeo é outra vantagem desde o experimentador escolhe quais as regiões para estudar e telha de diâmetro, adaptando a piscina para as suas necessidades individuais. Usando esta técnica, pode-se ensaio os efeitos de polimorfismos ou mutações na ligação em grande escala ou clone da biblioteca em um repórter de emenda funcional e identificar oligonucleotídeos que são enriquecidos na fração incluídos. Este romance in vitro de alta resolução esquema de mapeamento fornece uma forma única para estudar as interações RNP com transiente pré-mRNA espécies, cuja baixa abundância que torna difícil o estudo com atual em técnicas vivo.

Protocol

Projeto de recuperação da piscina e oligo

1. O primeiro passo é projetar a piscina pré-mRNA a ser estudado. Isto pode ser feito usando o navegador do Genoma UCSC e download de genes particular, junções de emenda, ou outras áreas de interesse.
2. Uma vez que as janelas de interesse foram selecionados, entre eles telha computacionalmente usando as seguintes condições: comprimento ler deve ser de 30 a 10 nucleotídeos com sobreposição de nucleotídeos, portanto, cada oligo é deslocado 20 nucleotídeos a partir da uma prévia. * Oligo sobreposição deve ser aumentada na proximidade de sítios de splice para garantir a cobertura adequada, aumentando a sobreposição 10-20 nucleotídeos pode fazer isso.
3. Flanco oligo cada 30 nucleotídeos com seqüências de primer universal, que será usado para amplificar a jusante da piscina. Ordens de azulejos oligo devem ser submetidos a Agilent, onde as seqüências serão impressos em um microarray oligonucleotídeo personalizado.
4. Para recuperar os oligos DNA a partir da superfície microarray começar por colocar a cobertura deslizante matriz em uma câmara de hibridação array e gentilmente pipetagem 500 mL de dH ₂ O para o slide
5. Sandwich matriz em cima do slide tampa, tendo o cuidado de evitar bolhas de ar que podem prejudicar o processo. Certifique-se de colocar o rosto disposição para baixo assim que o lado com o oligos está tocando a superfície da água. Uma boa regra de ouro é "Agilent Agilent toca" o que significa que o rótulo Agilent sobre a matriz enfrenta o rótulo Agilent no slide cobrir
6. Feche a câmara de hibridação e girar durante a noite a 99 ° C em um forno de hibridização
7. No dia seguinte, retire cuidadosamente a matriz da câmara e tirar fora da água, que agora contém os oligos liberados a partir da superfície da matriz. Esta é a piscina oligo
8. Coloque a piscina em um tubo Eppendorf 1,5 ml e sonicate da piscina em amplitude de 50% por 3-5 pulsos segunda
9. Em seguida, ampliar a piscina por baixo ciclo PCR, utilizando os primers universais com uma tag T7 anexados ao final. Para a primeira rodada, desnaturar a 94 ° C por 1 minuto, recozer a 55 ° C por 20 segundos, e alongada por 1 minuto a 72 ° C. Para as rodadas subseqüentes, fazer 10 segundos, 20 segundos e 10 segundos em cada temperatura respectivos, com uma etapa de alongamento final de 5 minutos a 72 ° C. Porque o número de ciclos necessários para amplificar a piscina depende da eficiência de recuperação oligo, pode ser necessário tentar números ciclo múltiplas. Tenha cuidado para não sobre-amplificar a piscina, que é representado por uma faixa manchada em um gel de acrilamida. Amostras de PCR amplificado podem ser armazenados a 4 ° C até ser necessário.
10. O passo final na preparação oligo é a transcrever RNA usando o MEGAshortscript Kit ™ do Ambion. * O protocolo a seguir foi adaptado de Ambion
    1. Descongele a T7 Tampão de reacção de 10x, quatro soluções ribonucleotídeo e água à temperatura ambiente, mantendo o Mix de enzimas T7 no gelo
    2. Montar a mistura de reação em um tubo de microcentrífuga RNase em temperatura ambiente. Componentes do tampão de reação pode causar DNA template para precipitar se a reação é misturada no gelo.
    3. Na seguinte ordem, pipeta 3 de água livre de nuclease mL, 2 mL do tampão de reação 10x, 2 mL de cada solução de 75 mM NTP, 5 mL de DNA modelo (o PCR amplificado piscina oligo) e 2 mL da enzima T7, para um volume final de 20 mL
    4. Flick o tubo suavemente para misturar a reação, em seguida, brevemente microcentrifugue para recolher a mistura na parte inferior do tubo.
    5. Incubar a reação em um termociclador a 37 ° C por 2 horas. Tempo de incubação será de modelo-dependente, portanto, pode ser necessário o uso de um experimento de tempo do curso para determinar o tempo de incubação ideais para a produção máxima
    6. Depois de duas horas, retire o DNA template adicionando 1 mL de DNase Turbo para a reação e incubar a 37 ° C por mais 15 minutos
    7. Terminar a reação e recuperar o RNA por extração de fenol / clorofórmio e precipitação de etanol.
       1. Para um volume de reação de 20 mL, adicione 115 mL de dH ₂ O e 15 mL de acetato de sódio 3 M para a reação.
       2. Misture bem em seguida, adicione 75 mL de fenol e 75 mL de clorofórmio ácidas. Misturar a solução em vortex, depois de microcentrífuga por um minuto a 13.000 rpm à temperatura ambiente. Transferir a fase aquosa para um novo tubo e repetir a extracção
       3. Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar 150 mL de clorofórmio. Vortex da mistura e centrífuga como antes. Transferir a fase aquosa para um novo tubo.
    8. Recuperar o RNA, adicionando dois volumes de 100% de etanol frio para a camada aquosa e misturando bem. Frio a mistura para um mínimo de 15 minutos a -20 ° C, em seguida, centrifugar a 4 ° C por 15 minutos na velocidade máxima para agregar as RNA. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 105 mL de 0,1 x Tampão Tris-EDTA (TE) ..
11. É difícil remover todos os nucleotídeos livres a partir da reação Kit T7, portanto, para os resultados mais precisos, quantificar o RNA usando RiboGreen.
    1. Para começar a quantificação, primeiro diluir o suficiente 1x TE, 2300 mL + 50μL/sample.
    2. Em seguida, faça o RiboGreen. Você vai precisar de 1.000 mL + 50 mL / amostra. Para amostras de gama alta (1 mg / mL a 20 ng / mL) misturar a 1:200 RiboGreen em 1x TE; para as amostras de gama baixa (50 ng / ml a 1 ng / mL) misturar a 1:2000 RiboGreen em 1x TE ; Pipetar 50 mL de solução RiboGreen em cada poço de uma placa opaca, começando com A1 e se movendo para baixo, e não através
    3. Diluir uma solução estoque RNA a 2 mcg / mL para as amostras de gama alta ou 100 ng / mL para as amostras de gama baixa
    4. Utilizando as soluções de ações, crie uma curva padrão por seis subseqüentes 01:02 diluições do 2 mg / mL ou 100 ações originais ng / mL; Pipetar 240 mL do estoque em um tubo de strip PCR. Nos restantes sete tubos, pipetar 120 mL de TE 1x. Levar até 120 mL do estoque RNA bem, e misture com o tubo 2. Levar até 120 mL de tubo 2 e misture com tubo de 3. Repita até que o tubo 7. Tubo de 8 só terá TE e será o seu em branco. Pipetar 50 mL das soluções da curva padrão na placa opaca, A1: H2 (executar a curva duas vezes)
    5. Em um novo tubo, misturar 45 mL de TE com 5 mL da piscina oligo e adicionar todos os 50 mL de um poço que contém 50 mL de RiboGreen.
    6. Usando um leitor de placa de configurar o aparelho para ler a fluorescência a partir do topo depois de uma mistura de um minuto com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 530 nm e ler a placa
    7. Use a curva padrão gerada para quantificar o RNA recuperado, o que deve ser armazenado a -20 ° C.

Co-imunoprecipitação da piscina com um oligo RNP de interesse

1. Antes do início do co-imunoprecipitação, prepare a Proteína A e Dynabeads Proteína G da Invitrogen, misturando-os em uma proporção de 1:1 até um volume final de 50 mL por reação. Por exemplo, para duas reações, é necessário adicionar 50 mL cada de cada grânulo.
2. Use um suporte Separação Magnética como este de Novagen para manter as contas no lugar enquanto você remover o sobrenadante e lavar as contas duas vezes com um volume igual de frio 1x PBS
3. Depois da segunda lavagem, ressuspender as contas em igual volume de PBS 1x fria e adicione 2 ng do anticorpo por reação. Este montante pode variar dependendo do anticorpo, assim experimentação é necessário encontrar as condições ideais.
4. Incubar a mistura de anticorpos / talão overnight a 4 ° C em uma plataforma rotativa
5. Na parte da manhã, adicione 2 mg por reação de RNA total sonicado levedura para bloquear ligações não específicas, e rodar por mais 30 minutos a 4 ° C.
6. Usando o rack magnético para manter as contas, remover o sobrenadante e lavar as contas duas vezes com PBS 1x frio, deixando o PBS a partir da segunda lavagem no tubo.
7. Retire novos tubos, um para cada reação e alíquota de 50 mL da mistura do grânulo em cada tubo. Vamos as contas se sentar enquanto preparava uma mistura principal
8. Para cada reação adicionar 200 ng da piscina oligo, uma relação equimolar de primers de proteção, 2 mg de RNA total em leveduras sonicado, 20 mL de extrato de HeLa nuclear (esta é a fonte RNP), e E buffer para reduzir o volume até 120 mL. Os primers de proteção são versões RNA dos primers universal. Modelos de ordem de transcrição dos primers universais com uma tag T7 anexados ao final, em seguida, transcrever RNA a partir de modelos usando o Kit MEGAshortscript ™.
9. Remover o sobrenadante do alíquotas de contas e miçangas ressuspender em 120 L do mix master. Rock the reações a 4 ° C por 1-2 horas.
10. Após a incubação, para cada reação, remover uma pequena alíquota (incluindo as contas) para um "total" amostra de RNA
11. Coloque o restante das reações na separação magnética de pé e retirar o sobrenadante. Embora não seja necessário analisar este fluxo a jusante, através da amostra, pode ser útil para salvar.
12. Lave as contas 1-2 vezes com 50 mL de frio 1x PBS. O RNA ligado ao anticorpo nas contas é a amostra "IP".
13. Ressuspender o "total" eo "IP" contas em 50 mL de SDS 1% em tampão 0,1 x TE e calor as amostras a 65 ° C por 15 minutos para eluir o RNA.
14. Remover o sobrenadante, que agora contém o RNA que foi previamente ligado ao contas e limpa por extração de fenol / clorofórmio, seguido por uma precipitação de etanol. Secar o pellet e ressuspender em 50 mL tampão TE 0,1 x.

Transcrição reversa e amplificação de co-IP amostras em preparação para a rotulagem aminoallyl

1. Em seguida, as amostras de RNA devem ser transcritas e reverter PCR amplificado. Para a reação de transcrição reversa, use os primers reverse universal.
2. Para cada amostra, comece por misturar 1 mL deo primer reverso universal, com 1 mL do modelo RNA (a partir da reação de imunoprecipitação) e 10 mL de dH ₂ O. Calor das reações a 70 ° C por 5 minutos e frio no gelo ou manter a 4 ° C.
3. Enquanto as amostras de arrefecer, completar o mix mestre seguinte. Para cada reação combinar 4 mL de 10 mM dNTPs, 2 mL de tampão Arrayscript 10x, um inibidor da RNase mL e 1 mL da enzima de transcrição reversa. Misturar bem e adicionar 8 mL da mistura de mestre para cada reação de transcrição reversa.
4. Use uma máquina de PCR para incubar as amostras a 42 ° C por 2 horas, seguido de 95 ° C por 5 minutos, depois de 4 ° C até as amostras são necessários para a amplificação.
5. Depois de reverter a transcrever as amostras de RNA, PCR amplificá-las utilizando os primers universais, com um dos primers contendo uma tag T7. O número de ciclos necessários para amplificar a piscina vai depender da eficiência da co-IP por isso pode ser necessário tentar vários ciclos. Cada reação requer 5 mL de tampão de reação 10x Taq, 0,2 mL de cada primer (100 mM), 1 mL do modelo cDNA (a partir da reação de transcrição reversa), 1 mL de 10 mM dNTPs, 42,2 mL de dH ₂ O, e 0,4 mL de enzima Taq.
   
   Comece a PCR, incubando as amostras a 94 ° C por 3 minutos. Em seguida, para cada ciclo de desnaturar, a 94 ° C por 45 segundos, recozer a 55 ° C por 30 segundos, e alongar a 72 ° C por um minuto, com um alongamento final a 72 ° C por 10 minutos.
6. Em seguida, transcrever as amostras novamente usando o MEGAshortscript Kit ™, no entanto, desta vez adicione 2 mL de aminoallyl UTP, em vez do UTP T7. A UTP aminoallyl será usado para rotular a RNA com os corantes Cy.
7. Fenol / clorofórmio e etanol precipitar as amostras. Não use Glycoblue ou acetato de amónio, sendo que ambos podem interferir com a hibridização das amostras para a matriz. Secar o pellet e ressuspender em 4,5 mL de 0,1 M de carbonato de sódio.

Amino-alil rotulagem de RNA com Corantes Cy

1. Para iniciar o protocolo de rotulagem dissolver cada um dos corantes fluorescentes, Cy3 e Cy5, em 45 mL de DMSO. Para evitar a luz, envolva os tubos em papel alumínio e armazenar a -20 ° C no escuro
2. Adicionar 2,5 mL de água livre de nuclease de RNA de amostras e misture bem
3. Em seguida, adicione 3 mL de Cy3 à amostra "total", e 3 mL de Cy5 à amostra "IP". Incubar as amostras no escuro por uma hora à temperatura ambiente; A amostra Cy-3 ficará vermelho ou rosa, enquanto o Cy-5 ficará azul.
4. Para terminar a reação, adicionar 6 uL de 4 M hidroxilamina-HCl a cada amostra, misturar bem e girar rapidamente. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
5. Purificar as amostras rotuladas por extração de fenol / clorofórmio, seguido pelo etanol precipitação e pellet ressuspender em 50 mL de 0,1 x TE

Hibridizar amostras para o microarray usando o Agilent Kit Hibridação Matriz

1. Comece a hibridização suavemente mistura de 50 mL de tampão de bloqueio de 10x, 140 mL de _O H2 nuclease-free, 25 mL do Cy3 marcado pool "total", 25 mL do Cy5 marcado pool "IP", 10 mL do buffer de fragmentação 25x e 250 mL do tampão de hibridação 2x, tendo o cuidado de evitar a introdução de bolhas. Microcentrífuga a amostra rapidamente para recolher a solução no fundo do tubo e também para reduzir bolhas.
2. Coloque o slide cobrir o-ring na câmara de hibridação e cuidadosamente pipeta a solução para o slide.
3. Coloque a matriz de detecção em cima do slide capa a "sanduíche" a solução. Lembre-se de orientar a matriz slide para que o rótulo Agilent sobre a matriz enfrenta o rótulo Agilent no slide tampa.
4. Prender o sanduíche de slide / matriz na câmara de hibridação e girar a 50 ° C por 3 horas.
5. Enquanto a matriz está girando, faça o seguinte 50 soluções mL em 50 mL tubos cônicos: uma cônica preenchido com 50 ml de dH ₂ O, duas soluções tampão 1x SCC, cada um em um tubo separado, e um tampão 2x SCC.
6. Após a incubação de três horas, cuidadosamente unclamp o sanduíche array / slide e coloque-o na 50 ml contendo o buffer SCC 2x. Usando um par de pinças, separar delicadamente a matriz a partir do slide tampa e retire a cobertura deslizante. Tenha cuidado para não tocar a matriz como o slide é puxado para fora. Feche a cônica e inverter cuidadosamente por 60 segundos.
7. Usando a pinça, a transferência da matriz para a solução SCC 1x, tampa do tubo, e inverter cuidadosamente por 1 minuto em seguida, transferir a matriz para a segunda solução SCC 1x e novamente inverter cuidadosamente por um minuto.
8. Por último, transferir a matriz para o tubo de dH ₂ O e inverter cuidadosamente por 30 segundos.
9. Seca a matriz, colocando as bordas do slide em um Kimwipe. Continue a girar a matriz sobre o wipe certificando-se de não perturbar o lado que contém a oligos.
10. Coloque a matriz em secoum tubo de 50 mL vazio cônica e digitalização com um scanner Microarray

Interpretando o Microarray

1. O scanner microarray irá criar uma imagem TIF da matriz. Executar esta imagem através do software de extração de recursos Agilent, usando o arquivo de grade (fornecido pela Agilent), que é exclusivo para a sua piscina específica.
2. O software Agilent irá interpretar o sinal em cada recurso para criar um arquivo, que é analisado com um script Perl. O sinal em cada recurso é normalizar a intensidade total em que canal. Por exemplo, em um recurso especial no canal verde, a intensidade do canal verde para o recurso individual é dividida pela intensidade total do canal verde sobre todos os recursos. O resultado final é a relação entre log do canal vermelho sobre o canal verde em cada característica da matriz.
3. Os dados piscina oligo do microarray pode ser re-mapeados de volta para o genoma para obter uma imagem de onde, e como fortemente, a RNP de interesse vinculado.

Figura 1. Esquema experimental

A. Tiling esquema. Depois de selecionar e baixar mRNA de pré-seqüências de interesse, a área de seleção é através de azulejos em 30 janelas de nucleotídeos que mudança em incrementos de 10 nucleotídeos. Universal cartilha flanco sítios de ligação de cada lado da janela.

B. Matriz de Síntese. Ordens de azulejos oligo devem ser submetidos a Agilent, onde as seqüências serão impressos em um microarray oligonucleotídeo personalizado.

C. Co-imunoprecipitação. Depois de ferver a oligos fora do array, incubar em HeLa extrato nuclear, em seguida, adicione o extrato de esferas magnéticas que são preparados com um anticorpo contra a RNP de interesse. Rótulo da piscina oligo começando com Cy3 ea piscina ligado IP com Cy5 e aplicam-se a matriz de detecção e digitalização.

Figura 2. Anotação do genoma com análise de dados e de enriquecimento.

A. Converter a pontuação média em cada coordenada genômico a partir dos dados da matriz para base dez log e mapa que a pontuação para as coordenadas dadas. Uma ilustração desta etapa média é dada por 3 sobreposição de 30 nt oligos com pontuação de 2, 4 e 0,5, onde a pontuação média de enriquecimento para cada janela de 10 nt é graficamente acima. As regiões genômicas selecionados pode ser visualizada usando uma faixa personalizada no navegador Genoma USCS. A janela do navegador exemplo dado é no gene clta, onde os recursos gene (exons / introns / splicing alternativo, etc) são dadas ao longo do fundo e dezenas log média de enriquecimento do oligos PTB-bound são representados por barras verticais em vermelho escuro. PTB fortemente liga-se logo acima do exon 2 no trato polypyrimidine.

Discussion

Ao fazer este procedimento é importante lembrar que a criação da piscina é flexível e aberto a modificações em uma ou outra o RNA ou o nível de proteína. No nível de RNA regiões ortólogos, mutações doença, polimorfismos ou mutações aleatórias podem ser introduzidos na seqüência de oligonucleotídeos. No nível de proteína do fator de ligação RNA podem ser modificados por fosforilação ou modificações pós-translacionais outros. Além disso, o ambiente de ligação pode ser manipulado para aumentar ou diminuir os níveis de fatores adicionais que interagem ou competir com a proteína RNA vinculação de interesse.