Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP's) op de menselijke pre-mRNA

Summary

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te bestuderen

Abstract

Sequencing RNA dat co-immunoprecipitaat (co-IP) met RNA-bindende eiwitten is ons begrip van splicing verhoogd door aan te tonen dat de binding locatie vaak invloeden functie van een splicing factor. Echter, zoals met alle monsters de strategie van de kans op het identificeren van een RNA gebonden aan een splicing factor is evenredig aan zijn cellulaire overvloed. We hebben een nieuwe in vitro benadering voor landmetingen bindingsspecificiteit anders is van voorbijgaande aard pre-mRNA. Deze aanpak maakt gebruik van een speciaal ontworpen oligonucleotide zwembad dat tegels in introns, exons, splitsen knooppunten of andere pre-mRNA. Het zwembad wordt onderworpen aan een soort van moleculaire selectie. Hier tonen we de methode van het scheiden van de oligonucleotide in een gebonden en ongebonden fractie en gebruik maken van een twee kleuren reeks strategie om de verrijking van elke oligonucleotide record in de gebonden fractie. De array data genereert hoge resolutie kaarten met de mogelijkheid om te identificeren sequentie-specifieke en structurele determinates van ribonucleoproteïne (RNP) bindend voor pre-mRNA. Een uniek voordeel van deze methode is de mogelijkheid om de bemonstering voorkeur voor mRNA geassocieerd met de huidige IP-en SELEX technieken te vermijden, zoals het zwembad is speciaal ontworpen en gesynthetiseerd uit de pre-mRNA-sequentie. De flexibiliteit van de oligonucleotide zwembad is een ander voordeel, omdat de onderzoeker kiest welke regio's om te studeren en tegels breed, op maat van het zwembad aan hun individuele behoeften. Met behulp van deze techniek kan men assay de effecten van polymorfismen of mutaties op binding op grote schaal of kloon van de bibliotheek in een functioneel splicing verslaggever en identificeren oligonucleotiden die verrijkt zijn met de meegeleverde fractie. Deze nieuwe in vitro met een hoge resolutie in kaart brengen regeling voorziet in een unieke manier om RNP interacties met tijdelijke pre-mRNA soorten, waarvan de lage overvloed maakt ze moeilijk te bestuderen met de huidige in-vivo-technieken te bestuderen.

Protocol

Pool ontwerp en oligo herstel

1. De eerste stap is om de pre-mRNA pool ontwerp te bestuderen. Dit kan worden gedaan met behulp van de UCSC Genome Browser en het downloaden van bepaalde genen, splits knooppunten, of andere gebieden van belang.
2. Zodra de ramen van belang zijn geselecteerd, tegel over hen computationeel met behulp van de volgende voorwaarden: lees de lengte moet 30 nucleotiden met een 10 nucleotide overlap, dus elke oligo is verschoven 20 nucleotiden van de voorafgaande een. * Oligo overlap moet worden verhoogd in de nabijheid van splice sites om een ​​adequate dekking te verzekeren, het verhogen van de overlap 10 tot 20 nucleotiden kunt dit doen.
3. Flank elke 30-nucleotide oligo met universele primer sequenties, die zal worden gebruikt om het zwembad stroomafwaarts te versterken. Betegelde oligo bestellingen dienen te worden voorgelegd aan Agilent, waar de sequenties wordt afgedrukt op een aangepaste oligonucleotide microarray.
4. Om te herstellen van de DNA-oligo's van de microarray oppervlak te beginnen door het plaatsen van de array deksel glijden in een array hybridisatie kamer en voorzichtig pipetteren 500 pi van dH ₂ O op de glijbaan
5. Sandwich de array op de top van het deksel glijden, zorg ervoor dat luchtbellen die het proces kan verstoren te vermijden. Zorg ervoor dat u de array gezicht plaats naar beneden, zodat de zijde met de oligo's raakt het oppervlak van het water. Een goede vuistregel is "Agilent raakt Agilent", wat betekent dat de Agilent label op de array de Agilent label gezichten op de cover slide
6. Sluit de hybridisatie kamer en draai de nacht bij 99 ° C in een oven hybridisatie
7. De volgende dag, verwijder de array uit de kamer en trek het water, die nu de oligo's bevrijd van de array oppervlak. Dit is de oligo zwembad
8. Plaats het zwembad in een 1,5 ml Eppendorf buis en ultrasone trillingen van het zwembad op 50% amplitude voor 3-5 seconden pulsen
9. Vervolgens versterken het zwembad door laagfrequente PCR, met behulp van de universele primers met een T7 tag toegevoegd aan het einde. Voor de eerste ronde, denatureren bij 94 ° C gedurende 1 minuut, bij 55 ° C gloeien gedurende 20 seconden, en gedurende 1 minuut bij 72 ° C. langwerpig Voor de daaropvolgende rondes, do 10 seconden, 20 seconden en 10 seconden bij elke respectieve temperatuur, met een uiteindelijke rek stap van 5 minuten bij 72 ° C. Omdat het aantal cycli noodzakelijk om de pool te versterken afhankelijk van de efficiëntie van oligo herstel, kan het noodzakelijk zijn om meerdere fietsen nummers te proberen. Wees niet te over-versterken van de pool, die wordt aangegeven door een band uitgesmeerd over een acrylamide gel. PCR geamplificeerde monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C totdat het nodig is.
10. De laatste stap in oligo voorbereiding is om RNA transcriptie van het gebruik van de MEGAshortscript ™ Kit van Ambion. * De volgende protocol is een aangepaste versie van Ambion
    1. Ontdooi de T7 10x reactiebuffer, vier ribonucleotide oplossingen en water op kamertemperatuur, terwijl het houden van de T7 Enzyme Mix op ijs
    2. Monteer het reactiemengsel in een RNase-vrije microcentrifugebuis bij kamertemperatuur. Onderdelen van de reactie buffer kan veroorzaken template-DNA neerslaan als de reactie wordt gemengd op het ijs.
    3. In de volgende volgorde, pipet 3 pi nuclease-vrij water, 2 pi van de 10x reactie buffer, 2 pi van elk 75 mM NTP-oplossing, 5 ul van template DNA (de PCR-geamplificeerde oligo zwembad) en 2 pi van T7 enzym, voor een uiteindelijk volume van 20 ui
    4. Flick de buis voorzichtig om de reactie vervolgens in het kort microfuge aan het mengsel te halen bij de bodem van de buis mix.
    5. Incubeer de reactie in een thermocycler bij 37 ° C gedurende 2 uur. Incubatietijd zal worden template-afhankelijk is, daarom kan het nodig zijn om een ​​tijd-cursus experiment te gebruiken om de optimale incubatietijd te bepalen voor de maximale opbrengst
    6. Na 2 uur, verwijdert u het template-DNA door het toevoegen van een pi van Turbo DNase om de reactie en incubeer bij 37 ° C voor een extra 15 minuten
    7. Beëindig de reactie en herstellen van de RNA door fenol / chloroform extractie en ethanol precipitatie.
       1. Voor een 20 pi reactie volume, voeg 115 ul van dH ₂ O en 15 pi van 3 M natriumacetaat toe aan de reactie.
       2. Meng goed en voeg dan 75 pi van de zure fenol en 75 pi chloroform. Meng de oplossing door vortexen, dan microfuge een minuut bij 13.000 rpm bij kamertemperatuur. Breng de waterige laag naar een nieuwe buis en de extractie herhalen
       3. Breng de waterige laag naar een nieuwe buis en voeg 150 pi chloroform. Vortex het mengsel en centrifuge als voorheen. Breng de waterige laag naar een nieuwe buis.
    8. Herstel de RNA door de toevoeging van twee volumes van 100% koude ethanol aan de waterige laag en mengen goed. Chill het mengsel voor een minimum van 15 minuten bij -20 ° C en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten bij een maximale snelheid tot pellet het RNA. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in 105 ui van 0.1x Tris-EDTA (TE) Buffer ..
11. Het is moeilijk om alle van de vrije nucleotiden van de T7 Kit reactie te verwijderen, dus voor de meest accurate resultaten, kwantificeren het RNA met behulp van RiboGreen.
    1. Om te beginnen de kwantificatie, eerst verdund genoeg 1x TE, 2300 pi + 50μL/sample.
    2. Vervolgens maken de RiboGreen. U moet 1000 pL + 50 pl / monster. Voor de hoge bereik monsters (1 ug / ml tot 20 ng / mL) mix de RiboGreen 1:200 in 1x TE, voor het lage monsters (50 ng / ml tot 1 ng / mL) mix de RiboGreen 1:2000 in 1x TE ; Pipetteer 50 ul van RiboGreen oplossing in elk putje van een ondoorzichtige plaat, te beginnen bij A1 en naar beneden, niet tussen de
    3. Verdun een RNA stockoplossing aan 2 ug / ml voor hoge bereik monsters of 100 ng / ul voor lage reeks monsters
    4. Met behulp van de voorraad-oplossingen, maakt u een standaard curve door zes latere 01:02 verdunningen van de oorspronkelijke 2 ug / ml of 100 ng / ml bouillon; Pipetteer 240 pi van de bouillon in een PCR-strip buis. In de overige zeven tubes, pipet 120 ul 1x TE. Goed plaatsvinden in 120 pi van de RNA-voorraad, en meng met buis 2. Neem 120 uL van buis 2 en meng met de buis 3. Herhaal dit totdat buis 7. Buis 8 hebben alleen TE en zal je blanco worden. Pipetteer 50 ul van de standaardcurve oplossingen in de ondoorzichtige plaat, A1: H2 (twee keer lopen de curve)
    5. In een nieuwe tube, meng 45 ul van TE met 5 pi van de oligo zwembad en voeg alle 50 ul van een goed dat 50 ul van RiboGreen bevat.
    6. Behulp van een plaat lezer de machine instellen om de fluorescentie van de top te lezen na een een-minuut mengen met een excitatie golflengte van 485 nm en emissie golflengte van 530 nm en de plaat te lezen
    7. Gebruik de standaard curve gegenereerd om de herstelde RNA kwantificeren zijn, die moet worden opgeslagen bij -20 ° C.

Co-immunoprecipitatie van de oligo zwembad met een RNP van belang

1. Voorafgaand aan het begin van de co-immunoprecipitatie, bereiden de Proteïne A en Proteïne G Dynabeads van Invitrogen door ze te mengen in een verhouding van 1:1 tot een eindvolume van 50 ul per reactie. Bijvoorbeeld, voor twee reacties die u zou toevoegen 50 pi elk van elke kraal.
2. Gebruik een Magnetische scheiding Stand zoals deze van Novagen naar de parels zijn plaats te houden terwijl u de bovenstaande vloeistof en spoel de kralen twee keer met een gelijk volume van koude 1x PBS
3. Na de tweede wasbeurt, resuspendeer de parels in een gelijk volume van koude 1x PBS en voeg 2 ng van het antilichaam per reactie. Dit bedrag kan variëren afhankelijk van het antilichaam, zodat experimenten is nodig om de optimale condities te vinden.
4. Incubeer de antilichaam / kraal mengsel overnacht bij 4 ° C op een draaiend platform
5. In de ochtend, voeg 2 pg per reactie van gesoniceerd gist totaal RNA om niet-specifieke binding te blokkeren, en draaien voor een extra 30 minuten bij 4 ° C.
6. Met behulp van de magnetische rek om de kralen te houden, verwijder het supernatant en was de kralen twee keer met koud 1x PBS, het verlaten van de PBS uit de tweede wassen in de buis.
7. Haal nieuwe buizen, een voor elke reactie en aliquot 50 pi van de kraal mengsel in elke buis. Laat de kralen zitten tijdens de voorbereiding een master mix
8. Voor elke reactie toe te voegen 200 ng van de oligo zwembad, een equimolaire verhouding van bescherming primers, 2 ug van gesoniceerd gist totaal RNA, 20 ul van HeLa nucleair extract (dit is de RNP bron), en de buffer E om het volume te brengen tot 120 pi. De bescherming primers zijn RNA-versies van de universele primers. Om transcriptie templates van de universele primers met een T7 tag toegevoegd aan het einde, dan transcriberen RNA uit de sjablonen met de MEGAshortscript ™ Kit.
9. Verwijder de bovenstaande vloeistof uit de kraal aliquots en resuspendeer kralen in 120 pi van de master mix. Rock de reacties bij 4 ° C gedurende 1-2 uur.
10. Na de incubatie, voor elke reactie, verwijderen van een kleine hoeveelheid (inclusief de kralen) voor een "totale" RNA monster
11. Plaats de rest van de reacties op de magnetische scheiding staan ​​en verwijder het supernatant. Hoewel het niet nodig om deze doorstroming te analyseren monster stroomafwaarts, kan het nuttig zijn om op te slaan.
12. Was de kralen 1-2 keer met 50 ul van koude 1x PBS. Het RNA gebonden aan het antilichaam op de kralen wordt het "IP" monster.
13. Resuspendeer de "totale" en de "IP" parels in 50 uL van 1% SDS in 0.1x TE-buffer en warmte de monsters bij 65 ° C gedurende 15 minuten om de RNA-elueren.
14. Verwijder de bovenstaande vloeistof, die nu het RNA, dat was vroeger gebonden aan de kralen en schoon door fenol / chloroform extractie gevolgd door een ethanolprecipitatie. Droog de pellet en resuspendeer in 50 uL 0.1x TE-buffer.

Reverse transcriptie en versterking van de co-IP monsters ter voorbereiding van aminoallyl etikettering

1. Vervolgens moet het RNA monsters reverse transcriptie en PCR versterkt. Voor de reverse transcriptie reactie, gebruik maken van de reverse universele primers.
2. Voor elk monster, te beginnen door het mengen van een ulde omgekeerde universele primer, met 1 pl van de sjabloon RNA (van de immunoprecipitatie reactie) en 10 pi van dH ₂ O. Verwarm de reacties bij 70 ° C gedurende 5 minuten daarna relaxen op ijs of bewaren bij 4 ° C.
3. Terwijl de monsters koel, de volgende master mix. Voor elke reactie te combineren 4 pi van 10 mM dNTPs, 2 pi van 10x Arrayscript buffer, 1 ui RNase-remmer, en 1 ui reverse transcriptie enzym. Meng goed en voeg 8 pi van de master mix aan elke reverse transcriptie reactie.
4. Gebruik een PCR-machine om de monsters incuberen bij 42 ° C gedurende 2 uur, gevolgd door 95 ° C gedurende 5 minuten, dan 4 ° C totdat de monsters nodig zijn voor versterking.
5. Na de reverse transcriptie van het RNA-monsters, PCR versterken door gebruik te maken van de universele primers, met een van de primers met een T7 tag. Het aantal cycli die nodig is om het zwembad te versterken zal afhangen van de efficiëntie van de co-IP dus het kan nodig zijn om meerdere cycli te proberen. Elke reactie vereist 5 pi van 10x Taq reactie buffer, 0,2 pi van elke primer (100 mm), 1 pi van het cDNA template (van de reverse transcriptie reactie), 1 ul 10 mM dNTPs, 42,2 ul van dH ₂ O, en 0,4 pi van Taq enzym.
   
   Begin van de PCR door het incuberen van de monsters bij 94 ° C gedurende 3 minuten. Vervolgens voor elke cyclus, denatureren bij 94 ° C gedurende 45 seconden, gloeien bij 55 ° C gedurende 30 seconden en verlengen bij 72 ° C gedurende een minuut, met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
6. Vervolgens de monsters opnieuw transcriberen met behulp van de MEGAshortscript ™ Kit, echter, deze keer toe te voegen 2 pi van aminoallyl UTP, in plaats van de T7 UTP. De aminoallyl UTP zal worden gebruikt om het RNA met de Cy kleurstoffen label.
7. Fenol / chloroform en ethanol neerslaan van de monsters. Gebruik GEEN Glycoblue of ammonium-acetaat, die beide kunnen interfereren met hybridisatie van de monsters aan de array. Droog de pellet en resuspendeer in 4,5 pi van 0,1 M natriumcarbonaat.

Amino-allyl etikettering van RNA met Cy Kleurstoffen

1. Om te beginnen de etikettering protocol te ontbinden elk van de fluorescerende kleurstoffen, Cy3 en Cy5, in 45 ul DMSO. Om te voorkomen dat licht, wikkel de tubes in aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C in het donker
2. Voeg 2,5 ul van nuclease-vrij water om monsters RNA en goed te mengen
3. Voeg vervolgens 3 pi van Cy3 naar de "totaal" monster, en 3 pi Cy5 naar de "IP" monster. Incubeer de monsters in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur; De Cy-3 sample wordt rood of roze, terwijl de Cy-5 wordt blauw.
4. Tot beëindiging van de reactie, voeg 6 uL van 4 M hydroxylamine-HCl aan elk monster, meng zorgvuldig en spin kort. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
5. Zuiver de gelabelde monsters door fenol / chloroform extractie gevolgd door ethanolprecipitatie en resuspendeer pellet in 50 ul TE 0.1x

Hybridiseren monsters aan de microarray met behulp van de Agilent array hybridisatie Kit

1. Begin de hybridisatie door voorzichtig mengen 50 uL van 10x blokkerende buffer, 140 ul van nuclease-vrij H2 _O, 25 pi van de Cy3-label "totaal" pool, 25 pi van de Cy5-label "IP" pool, 10 pi van de 25x fragmentatie buffer en 250 pi van de 2x hybridisatiebuffer, zorg om te voorkomen dat de invoering van bubbels. Microfuge het monster kort op de oplossing in de bodem van de buis ook te verzamelen en om bubbels te verminderen.
2. Plaats de o-ring deksel dia in de hybridisatie kamer en zorgvuldig de oplossing pipet op de dia.
3. Plaats de detectie reeks op de top van de deksel dia om "sandwich" de oplossing. Vergeet niet om de array oriënteren schuiven, zodat de Agilent label op de array wordt geconfronteerd met de Agilent etiket op de cover dia.
4. Klem de slide / array broodje in de hybridisatie kamer en draai bij 50 ° C gedurende 3 uur.
5. Terwijl de array draait, de volgende 50 ml oplossing in 50-ml conische buizen: een conische gevuld met 50 ml dH ₂ O, twee 1x SCC bufferoplossingen, elk in een afzonderlijke buis, en een 2x SCC buffer.
6. Na de drie-uur incubatie, zorgvuldig ontspan de array / dia sandwich en plaats deze in de 50 ml conische met de 2x SCC buffer. Met behulp van een pincet voorzichtig los van de array van het deksel glijden en trek het deksel dia. Wees voorzichtig niet aan de array als de slide is uitgetrokken te raken. Sluit de conische en voorzichtig omkeren gedurende 60 seconden.
7. Met behulp van de pincet, de array transfer naar het 1x SCC oplossing, cap de buis, en keer dan zachtjes gedurende 1 minuut dragen de array naar de tweede 1x SCC-oplossing en weer voorzichtig omkeren nog een minuut.
8. Ten slotte, de overdracht van de array om de buis van dH ₂ O en voorzichtig omkeren gedurende 30 seconden.
9. Droog de array door het plaatsen van de randen van de dia op een Kimwipe. Blijven aan de array te draaien op het doekje en zorg ervoor dat niet verstoren de kant met de oligos.
10. Plaats de droge array ineen lege 50-mL conische buis en scannen met een scanner Microarray

Het interpreteren van de Microarray

1. De microarray scanner zal een TIF-beeld van de array. Voer dit beeld door de Agilent Feature Extraction software, met behulp van het raster bestand (geleverd door Agilent), die uniek is voor uw specifieke zwembad.
2. De Agilent software interpreteert het signaal bij elke functie aan een bestand, dat wordt ontleed met een Perl-script te maken. Het signaal bij elke functie is normaliseren tot de totale intensiteit op dat kanaal. Bijvoorbeeld bij een bepaalde functie in het groene kanaal, is de intensiteit van het groene kanaal voor de individuele functie gedeeld door de totale intensiteit van de groene kanaal over alle functies. De uiteindelijke output is de log verhouding van het rode kanaal over het groene kanaal bij elke functie op de array.
3. De oligo zwembad gegevens van de microarray kan terug opnieuw toegewezen aan het genoom om een ​​beeld te krijgen van waar, en hoe sterk, de RNP van belang gebonden.

Figuur 1. Experimentele schema

A. Tegelwerk regeling. Na het selecteren en downloaden van pre-mRNA sequenties van belang, wordt het selecteren van gebied betegelde door in 30 nucleotide vensters die verschuiving in de 10 nucleotide stappen. Universele primer bindingsplaatsen flank elke zijde van het venster.

B. Synthese Array. Betegelde oligo bestellingen dienen te worden voorgelegd aan Agilent, waar de sequenties wordt afgedrukt op een aangepaste oligonucleotide microarray.

C. Co-immunoprecipitatie. Na het koken van de oligo's uit de array, incubeer in HeLa nucleair extract, voeg dan het extract aan magnetische korrels die bereid zijn met een antilichaam tegen het RNP van belang. Label de start oligo zwembad met Cy3 en de gebonden IP-zwembad met Cy5 en gelden voor de detectie array en scannen.

Figuur 2. Annoteren het genoom met en analyse van de verrijking van gegevens.

A. Zet de gemiddelde score op elk genomische coördineren van de array data naar base-tien log-en kaart die scoren op de gegeven coördinaten. Een illustratie van deze middeling stap is gegeven voor drie overlappende 30-nt oligos met scores van 2, 4 en 0.5, waar de gemiddelde score verrijking voor elke 10-nt venster boven is getekend. De geselecteerde genomische gebieden kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een Custom Track in de USCS Genome Browser. Het voorbeeld gegeven browservenster is in de clta-gen, waar gen features (exons / introns / alternatieve splicing etc.) worden gegeven langs de onderkant en log gemiddelde verrijking scores van de PTB-gebonden oligos worden vertegenwoordigd door donkerrode verticale balken. PTB bindt sterk net stroomopwaarts van exon 2 in de polypyrimidine darmkanaal.

Discussion

Bij het doen van deze procedure zijn belangrijk te weten dat oprichting van de pool herinneren is flexibel en dus vatbaar voor wijzigingen op een van beide het RNA of eiwit niveau. Op het RNA-niveau orthologe regio's, de ziekte van mutaties, polymorfismen, of willekeurige mutaties kunnen worden geïntroduceerd in de oligonucleotide sequentie. Op het eiwitgehalte van de RNA-bindende factor kan gewijzigd worden door fosforylering of andere post-translationele modificaties. Bovendien kan de binding omgeving worden gemanipuleerd om ofwel verhogen of verlagen van de niveaus van bijkomende factoren die een interactie of concurreren met de RNA-bindend eiwit van belang.