ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

Summary

pre - mRNAの一過性の性質のため、それは分離が困難になると勉強することができます

Abstract

RNA結合タンパク質との共免疫沈降（CO - IP）は、その結合位置を示すことによってスプライシングの我々の理解を増加していることをRNAをシーケンシングすることは、しばしばスプライシング因子の機能に影響を与えます。しかし、任意のサンプリングの戦略と同様にスプライシング因子に結合したRNAを識別するためのチャンスは、その細胞が豊富に比例する。我々は、pre - mRNAのそうでなければ、一時的に結合特異性を調査するためのin vitroでのアプローチで小説を開発している。このアプローチは、イントロン、エクソン、スプライスジャンクショ​​ン、またはpre - mRNAの他の間のタイルその特別に設計されたオリゴヌクレオチドのプールを利用しています。プールは、分子の選択のいくつかの種類に供される。ここでは、バインドおよび非バインド画分にオリゴヌクレオチドを​​分離することによって方法を示し、結合画分中の各オリゴヌクレオチドの濃縮を記録するには、2つの色の配列の戦略をたてて行う。配列データは、配列特異的および構造のpre - mRNAに結合リボ核タンパク質（RNP）のdeterminates識別する能力と高解像度のマップを生成します。プールは特別に設計されたとのpre - mRNAの配列から合成されるこの方法に固有の利点は、現在のIPとSELEX技術に関連するmRNAに向かって、サンプリングバイアスを避けるためにできることです。実験者は、個々のニーズにプールに仕立て、全体の研究やタイルにどの地域を選択するので、オリゴヌクレオチドプールの柔軟性は別の利点です。このテクニックを使用して、一つはアッセイ大規模に結合または機能的なスプライシングレポーターにライブラリのクローンを作成し、付属の画分に濃縮されているオリゴヌクレオチドを​​識別する上で多型または変異の影響をすることができます。 in vitroでの高解像度のマッピングスキームでこの小説は、低濃度生体技術の現在と一緒に勉強するためにそれらを困難にする一時的なpre - mRNAの種、とRNP相互作用を研究するユニークな方法を提供します。

Protocol

プールの設計とオリゴ回復

1. 最初のステップは、検討するのpre - mRNAのプールを設計することです。これは、UCSCゲノムブラウザを使用して、特定の遺伝子、スプライスジャンクショ​​ン、またはその他のテーマをダウンロードし実行することができます。
2. 興味のあるウィンドウを選択したら、計算上、次の条件を使用してそれらの間のタイル：長さを読み取るには、各オリゴは前日から20ヌクレオチドを​​シフトさゆえ、10塩基のオーバーラップと30ヌクレオチドである必要があります。 *オリゴのオーバーラップは、十分なカバレッジを確保するためのスプライス部位に近接して大きくする必要があります。10から20ヌクレオチドからオーバーラップを大きくすると、これを達成することができます。
3. プールの下流を増幅するために使用されるユニバーサルプライマー配列、それぞれ30塩基オリゴ脇腹。タイル張りのオリゴの注文は、配列がカスタムオリゴマイクロアレイに印刷されるアジレント、に提出する必要があります。
4. マイクロアレイ表面からDNAオリゴを回復するには、アレイハイブリダイゼーションチャンバー内の配列カバースライドを置き、静かにスライド上のdH ₂ Oを500μLをピペッティングすることから始める
5. カバーのスライドの上にサンドイッチは、配列、プロセスを混乱させることができる空気の泡をしないように注意しながら。オリゴを用いた側が水の表面に触れているので、アレイ面を下に配置してください。よい経験則は、アレイ上のAgilentのラベルが、カバースライドでAgilentのラベルに直面していることを、"アジレント触れるアジレント"の意味です。
6. ハイブリダイゼーションチャンバーを閉じて、ハイブリダイゼーションオーブンで99 ° Cで一晩回転する
7. 翌日は、慎重にチャンバーからアレイを削除し、現在はオリゴアレイの表面から遊離を含む水を、オフ描く。これは、オリゴプールです。
8. 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにプールを置き、3〜5秒パルスの振幅の50％でプールを超音波で分解する
9. 次に、最後に追加さT7タグとユニバーサルプライマーを用いて、低サイクルPCRでプールを増幅する。のための94の最初のラウンド、変性℃で1分間、20秒間55℃でアニールし、72℃1分間、伸長℃にその後のラウンドの場合、10秒、20秒、10秒間は72で5分間の最終伸長工程℃で、それぞれの温度で行うことプールを増幅するために必要なサイクル数は、オリゴの回収効率に依存するので、それは複数のサイクル数を試してみる必要があるかもしれません。アクリルアミドゲルに塗抹バンドで示されているプールを、過剰増幅しないように注意してください。必要になるまでPCR増幅したサンプルを4℃で保存することができます。
10. オリゴの準備の最後のステップは、Ambion社からMEGAshortscript™キットを用いてRNAを転写することです。 *以下のプロトコールはAmbion社から適応されています
    1. 氷の上にT7酵素ミックスを維持しながら、室温で、4つのリボヌクレオチドのソリューションと水をT7 10 ×反応バッファーを融解
    2. 室温でRNaseフリーのマイクロ遠心チューブ内の反応混合物を組み立てます。反応は氷上で混合されている場合、反応バッファーの成分は沈殿するため、鋳型DNAを引き起こす可能性があります。
    3. 次の順序で、ピペット3μLのヌクレアーゼフリー水、10 ×反応緩衝液2μL、各75mMのNTP溶液2μL、テンプレートDNAの5μL（PCR増幅オリゴプール）とT7酵素の2μL、用20μLの最終容積
    4. チューブは、チューブの底に混合物を収集するして簡単にマイクロ反応を混在させる穏やかにフリックします。
    5. ℃で2時間37℃でサーマルサイクラーで反応します。インキュベーション時間は、テンプレートに依存するでしょう、したがって、それは最大生産のための最適なインキュベーション時間を決定するためにタイムコース実験を使用する必要があります
    6. 2時間後、さらに15分間37℃で反応し、インキュベートするターボDNaseの1μLを加える° Cの方法でテンプレートDNAを除去
    7. 反応を終了し、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりRNAを回復する。
       1. 20μLの反応液量の場合、反応するのdH ₂ Oの115μL、3 M酢酸ナトリウムの15μLを加える。
       2. その後、充分に混和クロロホルムの酸性フェノールと75μLの75μLを加える。ボルテックスで溶液を混合し、室温で13,000 rpmで1分間のために微量。新しいチューブに水層を移し、抽出を繰り返す
       3. 新しいチューブに水層を移し、クロロホルム150μLを加える。渦以前のように混合し、遠心。新しいチューブに水層を移す。
    8. 水層を100％冷2倍量のエタノールを加えるとよく混合することにより、RNAを回復する。 -20℃で15分間Cの最小値については混合物を冷却すると、その後4℃で遠心℃で15分間、最高速度でペレットRNAに。注意深く上清を除去し、0.1 ×トリス- EDTA（TE）のBuffer 105μLでペレットを再懸濁します..
11. それは、T7キットの反応から遊離ヌクレオチドのすべてを削除するので、最も正確な結果を得るため、RiboGreenを使用してRNAを定量化することは困難である。
    1. 定量を開始するには、まず2300μL+50μL/sample、十分な1 × TEを希釈する。
    2. 次に、RiboGreenを行います。あなたは1000μL+ 50μL/サンプルが必要になります。高レンジのサンプルについて（20 ng / mLを1μg/ mL）を1 × TEにRiboGreen 1:200を混在させること、低域の試料のために（1 ng / mLの50 ng / mL）を1 × TEにRiboGreen 1:2000を混ぜる;ピペット不透明プレートの各ウェルにRiboGreen溶液50μL、A1から始まると上下に移動、ではない全体の
    3. 高レンジのサンプルや低域の試料については100 ng /μLの2μg/ mlのRNAス​​トック溶液を希釈する
    4. ストック溶液を使用して、オリジナルの濃度2μg/ mLまたは100 ng / mLの株式六その後の午前1時02希釈で検量線を作成し、PCRストリップチューブに株式のピペット240μL。残りの7チューブで、ピペット1 × TEの120μL。よくRNAストックから120μLを取る、とチューブ2と混ぜる。チューブ2とチューブ3とのミックスから120μLを取る。管7まで繰り返します。チューブ8は、TEを持つことになりますし、空白になります。不透明なプレート、A1に標準曲線のソリューションのピペット50μL：H2（回線を作成して）
    5. 新しいチューブに、オリゴプールの5μLをTE 45μLを混合し、RiboGreen 50μLを含むウェルにすべての50μLを加える。
    6. プレートリーダーを使用すると、485 nmと530nmの発光波長の励起波長との間に1分間混合した後、上部からの蛍光の読み取りとプレートを読み取るためにマシンを設定する
    7. -20℃で保存する必要がある回復RNAを定量化するために作成した標準曲線を、使用してください

興味のRNPとオリゴプールの共免疫沈降

1. 前の共免疫沈降を開始する、とInvitrogen社からプロテインGのダイナビーズ反応当たり50μLの最終容量に1:1の比率でそれらを混合することによりタンパク質を調製。例えば、2つの反応のために、50μL、各ビーズのそれぞれを追加します。
2. あなたが冷たい1 × PBSの等量で二回上清を除去し、ビーズを洗浄しながら場所にビーズを保持するためにNovagenからこのような磁気分離スタンドを使用して、
3. 回目の洗浄後、冷1 × PBSの等量でビーズを再懸濁し、反応当たりの抗体の2 ngのを追加。この量は抗体によって異なる場合があります、実験では最適な条件を見つけるために必要ですので。
4. 4℃抗体/ビーズ混合物は一晩インキュベートする回転台上で° C
5. 午前中は、非特異的結合をブロックするために超音波酵母全RNAの反応あたり2μgのを追加し、4℃でさらに30分間回転させる℃に
6. ビーズを保持する磁気ラックを使用すると、チューブに回目の洗浄からPBSを残して、冷1 × PBSで2回上清を除去し、ビーズを洗浄する。
7. 新しいチューブに、各反応と各チューブにビーズ混合物のアリコート50μLのための1つを取り出してください。マスターミックスを準備中にビーズを座らせて
8. それぞれの反応を120にボリュームを立ち上げるために200のオリゴプールのngの、保護のプライマーのモル比は、超音波処理した酵母全RNAを2μg、HeLa細胞核抽出物（これはRNPソースである）20μL、およびバッファのEを追加するμL。保護のプライマーはユニバーサルプライマーのRNAバージョンです。最後に追加さT7タグとユニバーサルプライマーの注文の転写用テンプレートは、その後MEGAshortscript™キットを使ってテンプレートからRNAを転写する。
9. マスターミックスの120μLのビーズアリコートを再懸濁しますビーズから上清を取り除きます。 4℃で1-2時間反応を揺らし。
10. インキュベーション後、各反応について、"合計"RNAサンプルのために小さなアリコートを（ビーズを含む）を削除
11. 磁気分離スタンドでの反応の残りの部分を置き、上清を取り除く。それがこのフロースルーサンプルの下流を解析する必要はありませんが、それは保存するのに役に立つかもしれません。
12. 冷1 × PBSの50μLでビーズ1〜2回洗浄する。ビーズ上に抗体に結合したRNAは、"IP"のサンプルです。
13. "合計"と0.1 × TE緩衝液中のSDS 1％の50μLの"IP"ビーズを再懸濁し、RNAを溶出するために15分間65℃でサンプルを加熱する。
14. 今、以前にエタノール沈殿に続くフェノール/クロロホルム抽出によりビーズときれいにバインドされたRNAを含む上清を、取り除く。ペレットを乾燥し、50μLの0.1 × TEバッファーに再懸濁します。

アミノアリル標識の準備のために逆転写と共同IPサンプルの増幅

1. 次に、RNAサンプルを逆転写とPCRは、増幅する必要があります。逆転写反応の場合は、逆ユニバーサルプライマーを使用してください。
2. 各サンプルについて、1μLを混合することにより開始テンプレートRNAの1μL（免疫沈降反応からの）とのdH ₂ Oを10μLと逆ユニバーサルプライマー、 ℃で5分間、その後、氷上で冷やしたり、4℃に保つ70℃で反応を加熱する
3. サンプル涼しいしながら、以下のマスターミックスを作る。各反応についての10mMのdNTP4μLの、10倍Arrayscriptの緩衝液2μL、1μLのRNase阻害剤、及び1μL逆転写酵素を組み合わせる。完全に混和し、それぞれの逆転写反応にマスターミックスの8μLを加える。
4. サンプルは増幅に必要になるまで42℃95で続いて2時間、℃で5分間、その後4℃でサンプルをインキュベートするためにPCRマシンを使用してください。
5. 逆RNAサンプルを転写した後、PCRはT7のタグを含むプライマーの一方で、ユニバーサルプライマーを用いて、それらを増幅する。それは複数のサイクルを試してみる必要がある場合がありますので、プールを増幅するために必要なサイクル数は、CO - IPの効率に依存します。各反応は10倍のTaq反応緩衝液5μL、各プライマー0.2μL（100 mM）を、鋳型cDNAの1μL（逆転写反応から）、10mMのdNTPを1μL、のdH ₂ Oの42.2μL、およびが必要です。 Taq酵素の0.4μL。
   
   3分間94℃でサンプルをインキュベートすることにより、PCRを始めます。次に、94℃各サイクル、変性用℃、45秒Cは、30秒間55℃でCをアニールし、10分間72℃での最終伸長と、1分間、72℃で細長い。
6. 次に、再びMEGAshortscript™キットを使用してサンプルを書き写す、しかし、この時間は2アミノアリルUTPのμL、代わりにT7 UTPを追加します。アミノアリルUTPは、Cy色素でRNAを標識するために使用されます。
7. フェノール/クロロホルムとエタノールは、サンプルを沈殿させる。 Glycoblueまたは酢酸アンモニウムを使用しない、どちらも配列へのサンプルのハイブリダイゼーションを妨げる可能性があります。 0.1 Mの炭酸ナトリウム4.5μLでペレットを再懸濁しますを乾かします。

Cy色素を持つRNAのアミノアリルラベリング

1. ラベリングのプロトコールを開始するには、DMSOの45μLに、蛍光色素、Cy3とCy5のそれぞれを溶解する。光を避けるために、暗所で-20℃でアルミ箔とストア内のチューブをラップ
2. サンプルのRNAと完全に混合するヌクレアーゼフリー水2.5μLを追加
3. 次に、"IP"のサンプルに"合計"のサンプルにCy3を3μL、およびCy5の3μLを加える。室温で1時間、暗所でサンプルをインキュベートして、CY - 5は青色になる一方のCy - 3のサンプルは、赤やピンクに変わります。
4. 反応を終了するには、、各サンプルに4 Mヒドロキシルアミン塩酸の6 ULを追加してよく混合し、手短にスピン。室温で15分間インキュベートする。
5. 0.1 × TE 50μLに、エタノール沈殿し、ペレットを再懸濁します続いてフェノール/クロロホルム抽出により標識サンプルを精製

アジレントアレイのハイブリダイゼーションキットを使用してマイクロアレイにサンプルをハイブリダイズ

1. 軽く10倍のブロッキングバッファー50μLを混合することによりハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼフリーH2 _Oの140μL、Cy3標識"合計"のプール、Cy5標識"IP"プールの25μL、10μLの25μLを始める25倍の断片化バッファーと2倍のハイブリダイゼーション緩衝液250μL、気泡を導入しないように注意しながら。チューブの底に溶液を回収するために、また、気泡を減らすために簡単にサンプルをマイクロフュージ。
2. ハイブリダイゼーションチャンバーのOリングのカバーのスライドを置き、慎重にスライド上に溶液をピペットで。
3. "サンドイッチ"ソリューションへのカバーのスライドの上に検出配列を置きます。アレイ上のAgilentのラベルは、カバーのスライドでAgilentのラベルを向くように配列のスライドに覚えている。
4. ハイブリダイゼーションチャンバーにスライド/配列サンドイッチをクランプし、3時間、50℃で回転する。
5. のdH ₂ O 50mLの、二つの1 × SCC緩衝液、別のチューブにそれぞれ、一倍SCCのバッファーで満たされた円錐形のいずれかのアレイが回転している間は、50 mLコニカルチューブに以下の50 mLのソリューションです。
6. 三時間のインキュベーション後、注意深く配列/スライドサンドイッチをアンクランプし、2倍のSCCのバッファを含む50 mLコニカルに入れてください。ピンセットを使用して、静かにカバーをスライドから配列を分離し、カバースライドを引き出します。スライドが引き出されているように配列を触れないように注意してください。円錐を閉じて、静かに60秒間転倒混和。
7. ピンセットを使用して、1 × SCCソリューションに配列を転送する、キャップチューブ、そして穏やかに1分間反転すると、2番目の1 × SCCソリューションに配列を転送し、再び静かに別の分のために反転させる。
8. 最後に、のdH ₂ Oのチューブに配列を転送し、穏やかに30秒間転倒混和。
9. キムワイプでスライドのエッジを配置することにより、配列を乾かします。の配列を回転し続けるオリゴを含む側を混乱しないように確実に拭いてください。
10. で乾燥した配列を配置マイクロアレイスキャナーを使用して空の50 mLコニカルチューブとスキャン

マイクロアレイの解釈

1. マイクロアレイスキャナーでは、配列のTIFイメージを作成します。特定のプールに固有のグリッドファイルを（アジレントが提供）を使用して、Agilentの特徴抽出ソフトウェアを介してこのイメージを実行します。
2. AgilentのソフトウェアはPerlスクリプトで解析されるファイルを、作成する各機能の信号を解釈します。各機能の信号はそのチャンネルで全強度に正規化されています。緑のチャネルの特定の機能では例えば、個々の機能のための緑のチャネルの強度は、すべての機能上の緑のチャネルの全強度で除算されます。最終的な出力は、アレイ上の各機能における緑のチャネルを介して赤チャンネルの対数比です。
3. マイクロアレイからのオリゴプールのデータは、画像を取得するためにゲノムに戻って再マッピング、およびどのように強く、興味のRNPは、バインドすることができます。

図1。実験回路図

A.は、タイルスキーマを。興味のpre - mRNAの配列を選択し、ダウンロードした後、選択エリアは、10ヌクレオチド単位でシフト30ヌクレオチドのウィンドウでを介してタイル張りです。ウィンドウのユニバーサルプライマー結合部位の側面は、それぞれの側。

B.合成配列。タイル張りのオリゴの注文は、配列がカスタムオリゴマイクロアレイに印刷されるアジレント、に提出する必要があります。

C.共同免疫沈降。配列からオリゴを煮沸後、HeLa核抽出液でインキュベートして、関心のRNPに対する抗体を用いて調製されている磁気ビーズへの抽出を追加。 Cy3で始まるオリゴプールおよびCy5でバインドされたIPプールにラベルを付け、検出配列とスキャンに適用されます。

図2。とゲノムと濃縮のデータの分析に注釈を付ける。

A.は、配列のデータから、指定された座標にスコアその10を底とログとマップのそれぞれのゲノム座標での平均スコアに変換します。この平均化ステップの図は、ウィンドウが上記のグラフ化され、各10 - ntの平均濃縮スコア2得点、4、0.5、3オーバーラップの30 NTのオリゴのために与えられます。選択されたゲノム領域はUSCSのゲノムのブラウザでカスタムトラックを用いて可視化することができます。与えられた例のブラウザウィンドウには、遺伝子の機能（エクソン/イントロン/選択的スプライシング等）は暗赤色の縦線で表現されているPTB -結合オリゴから下とログの平均濃縮得点に沿って与えられるcltaの遺伝子の中にあります。 PTBは、強くピリミジン管でエクソン2のちょうど上流に結合する。

Discussion

プールのその作成を覚えてこの手順を、その重要を行うときには、RNAまたはタンパク質のレベルのいずれかで柔軟性があり、変更に開いています。 RNAレベルでオルソロガス地域、病気の変異、多型、またはランダム突然変異はオリゴヌクレオチド配列を導入することができる。タンパク質レベルでのRNA結合因子は、リン酸化または他の翻訳後修飾によって変更することができます。また、束縛環境をどちらか興味のRNA結合タンパク質と相互作用または競合する追加の因子のレベルを増減する操作することができます。